Extractia adn din orice e viu

EXTRACTIA ADN DIN ORICE E VIU

                                            

ADN-ul este molecula informationala care se gaseste in toate organismele vii. Molecula de ADN este alcatuita din 2 lanturi polinucleotidice complementare legate prin legaturi fosfodiesterice, cu bazele azotate spre interior si gruparile fosfat spre exterior. Bazele azotate sunt legate prin punti de hidrogen (A=T; G≡C).

La plante si animale, majoritatea ADN-ului se afla in nucleu, de aceea pentru extractia sa este nevoie de distrugerea peretelui celular.

Orice metoda de extractie a ADN-ului cuprinde urmatoarele etape:

1.     alegerea materialului biologic;

2.     distrugerea peretelui celular in scopul eliberarii continutului (liza celulara); in aceasta etapa, ADN-ul este scos din interiorul nucleului;

3.     separarea ADN-ului de debriurile (fragmentele) celulare.

ETAPELE  EXTRACTIEI  ADN

Pasul 1. Se pun intr-un blender urmatoarele

• 1/2 cana de material biologic (100ml)
• 1/8 lingurita de sare de masa (mai putin de 1ml)
• 1 cana de apa rece (200ml)

Blend la maximum, 15 sec. Miscarea si fortele fizice din blender distrug peretele celular.

Obs. Apa rece creste randamentul de obtinere a unei cantitati mari de ADN si protejeaza molecula de ADN de enzimele care pot sa-l rupa.

Apa sarata ajuta ADN-ul sa precipite (solidifica si apare) cand se adauga alcool.

Pasul 2. Adaugare de detergent

Se strecoara "supa" obtinuta la pasul 1 si se pune intr-un alt recipient (cam o cana).

Se adauga 2 linguri de detergent (~30mL) si se amesteca.

Se lasa amestecul sa stationeze 5-10 min.

Amestecul obtinut se toarna in recipienti mici, astfel incat sa fie 1/3 plini.

Detergentul are rolul de a rupe membranele lipidice.

Pasul 3. Adaugare de enzime

Se adauga o cantitate mica de enzima si se amesteca apoi, cu mare grija pentru a evita ruperea ADN-ului (daca ADN-ul se rupe, va fi mai greu de vazut

Ca enzime se folosesc: bromelaina, ficina, papaina, actinidina.

Ca surse de enzime, se pot folosi: suc de ananas (bogat in papaina), papaya, smochine, ghimbir, kiwi, solutie de sters lentilele de contact.

In celula, ADN-ul este asociat cu proteine (histone) cu rolul de a stabiliza structura ADN-ului, de a-l proteja.

Enzimele au rolul de a taia aceste proteine care ajuta si la impachetarea ADN.

Pasul 4. Precipitarea ADN ului cu alcool

Se inclina usor tubul cu proba si se adauga incet alcool rece (70-95% alcool izopropilic sau alcool etilic) care va forma un strat in partea de sus a tubului.

Volumul de alcool introdus = volumul de proba din tub

ADN-ul va trece in stratul de alcool. Se poate utiliza un betisor de lemn

Obs. Alcoolul rece mareste randamentul de obtinere a ADN si, de asemenea, ajuta ADN-ul sa precipite mai repede.

Alcoolul este mai putin dens decat apa, asadar va pluti la suprafata. Deoarece se formeaza doua straturi diferite, toate grasimile si proteinele pe care le-am scos in primii doi pasi se vor aseza in partea de jos, apoasa, in timp ce ADN -ul prefera partea de sus, alcoolica.

ADN-ul extras se poate pastra in tampon TE (Tris-EDTA) pH= 8, pentru a-l proteja de actiunea enzimelor, care-l pot rupe.