LUCRARE DE DIPLOMA Pentru obtinerea titlului de 'Doctor medic veterinar' - Influenta infectiei cu virusul leucozei enzootice bovine si a starii de hipersensibilizare tuberculinica asupra concentratiei imunoglobulinelor G circulante la animale adulte

UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRICOLE

CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE MEDICINA VETERINARA

DISCIPLINA: BOLI INFECTIOASE

LUCRARE DE DIPLOMA

Pentru obtinerea titlului de 'Doctor medic veterinar'

Influenta infectiei cu virusul leucozei enzootice bovine si a starii de hipersensibilizare tuberculinica asupra concentratiei imunoglobulinelor G circulante la animale adulte

CUPRINS

Introducere

Partea I - Date bibliografice

Cap. I - Leucoza enzootica bovina. Generalitati.

Cap. II - Modificari ale profilului imunologic la bovine infectate cu virusul leucozei enzootice bovine

II. 1. Modificari ale efectorilor imuni umorali. Interferonii.

Influenta infectiei cu virus LEB asupra efectorilor imuni
celulari.

Modificari legate de alterarea supravegherii imune.
Cap.III - Tuberculoza. Generalitati.

Cap. IV - Perturbatori ale activitatii imune in conditii de hipersensibilizare tuberculinica

IV. 1. Efectori imuni umorali implicati
IV. 1.1. Lizozimul
IV. 1.2. Complementul

IV. 1.3. Properdina

IV.2. Efectori imuni celulari implicati

IV.2.1. Fagocite polimorfonucleare

IV.2.2. Fagocite mononucleare

Cap. V - Metode de dozare a concentratiei IgG circulante

V.l. Difuzia simpla bidimensionala (Testul Mancini)

V.2. Imunoelectroforeza

V.3. Anticorpii monoclonali

Imunofluorescenta

ELISA

Partea a II-a - Cercetari proprii, Scopul lucrarii

Cap. I - Material biologic

Probe biologice

Metode de prelevare si pastrare

Cap. II - Utilizarea metodei Mancini pentru dozarea IgG, folosind reactivi standard. Scara etalon.

II. 1. Materiale si metode

Rezultate

Discutii

Cap. III - Evaluarea concentratiei IgG la bovine cu leucoza enzootica bovina si hipersensibilizarea tuberculinica prin metoda Mancini

III. 1. Materiale si metode

Rezultate

Discutii

Cap. IV - Influenta extractului de Calendula si Echinaceea asupra concentratiei de IgG circulante la bovine cu LEB si hipersensibilizarea tuberculinica prin metoda Mancini

IV. 1. Materiale si metode
IV.2. Rezultate

IV.3. Discutii

Concluzii

Bibliografie

INTRODUCERE

Leucoza enzootica bovina si tuberculoza sunt recunoscute drept boli care produc pierderi mari in efectivele de animale atat prin scaderea productiilor cat si prin obligativitatea instituirii masurilor de carantina in scopul asanarii efectivelor contaminate.

Pana in 1956 in Romania nu au existat semnalari clinice sau de abator care sa sustina prezenta leucozei. Dupa aceasta perioada, datorita importurilor de bovine din rasele rosii indeosebi cin Danemarca, incidenta leucozei enzootice a inceput sa creasca. Primele observatii asupra bolii au aparut dupa depistarea a cinci cazuri cu leucoza generalizata la abatorul din Bucuresti in 1966.

Pornind de la aceste constatari, aria investigatiilor serologice prin ID a fost largita iar animalele depistate pozitive au fost sacrificate, astfel incat incidenta pozitivitatii a scazut. Privind retrospectiv, evolutia leucozei enzootice bovine in tara noastra a cunoscut periodic episoade de extindere.

primul peak a fost inregistrat intre 1964 si 1969 - care corespunde cu importul de animale, consecinta acestui episod fiind sacrificarea a peste 18 000 de bovine.

al doilea peak a fost semnalat intre 1973 si 1977 dupa achizitionarea de bovine din rasa HF din Germania (din landurile intens contaminate) si din Israel.

al treilea peak a fost semnalat cu incepere din 1990 o data cu contaminarea bovinelor proprietate particulara, situatia actuala fiind pe cale de stabilizare in momentul de fata.

Tuberculoza este una din cele mai vechi si mai grave boli intalnita la toate animalele dar care provoaca pierderi mai ales la bovine. Tuberculoza este semnalata in toate tarile lumii; fiind boala cu cea mai larga raspandire. La bovine este mai frecventa in tarile in care se practica cresterea intensiva (si in Romania) in marile unitati, cuprinzand adeseori efectivele in masa evoluand cu precadere la animalele de mare randament si mai cu seama la vacile de lapte.

Infectia tuberculoasa provoaca pierderi economice mari, mai ales in sectorul bovin prin:

confiscari ale carnii

scaderea productiei de lapte cu cca 12 %

reducerea duratei de exploatare a animalelor

cheltuieli ocazionale cu combaterea bolii

La acestea se mai adauga si faptul ca tuberculoza este o antropozoonoza grava, infectia la om putand avea loc atat cu tipul bovin cat si cu cel aviar (infectii atipice).

Cunoasterea modificarilor imunologice produse in urma infectiei si diagnosticarea in timp util a acestor boli atat la animale cat si la om (tuberculoza) duce la o mai buna prevenire si aplicarea corecta a masurilor de profilaxie si combatere.

PARTEA A -I a

DATE BIBLIOGRAFICE

CAPITOLUL I

LEUCOZA ENZOOTICA BOVINA

Generalitati

Virusul cauzal al bolii a fost identificat in 1964 in lapte si apoi in serul provenit de la vacile leucemice. Considerat o entitate distincta doar in zilele noastre acest virus a fost asezat alaturi de virusurile HTLV I si HTLV II recunoscuti ca agenti etiologici al leucemiilor umane.

In etiologia leucozei sporadice se presupune ca intervine un alt virus decat cel al leucozei enzotice bovine. Sunt receptivi la leucoza enzootica bovina - bovinele (Bos taurus si Bos indicus) si bubalinele de toate varstele dar cazurile cele mai frecvente apar la 4-8 ani, la rasele rosii si la cele de mare productivitate (lapte). Pentru cultivarea virusului initial s-au folosit limfocitele leucemice, apoi co-cultivarea acestora cu fibroblaste embrionare, bovine si aviare.

Leucoza enzootica. Perioada de incubatie este lunga fiind de la cateva luni pana la 1-5 ani. Le disting o forma leucemica mai frecventa 90 % din cazuri cu doua faze de evolutie: limfocitoza persistenta si tumorala.

Limfocitoza persistenta se exprima numai pin modificari ale elementelor celulare sangvine in special ale seriei albe.

Faza tumorala apare la animalele de 5-8 ani si se manifesta prin inapetenta, depresie, astenie, scaderea productiei de lapte dupa care cuprind limfonodurile care de cele mai multe ori isi pastreaza forma, insensibili, bine delimitati, mobili subcutanati. In unele cazuri procesul tumoral cuprinde si testul perilinfonodular.

Leucoza sporadica cu 3 forme morfoclinice:

a) Forma juvenila - (leucoza multicentrica a viteilor) la animale de pana la 2 ani are o evolutie acuta si se exprima prin astenie, anemie, diaree, leucocitoza si limfocitoza moderata constant cu scaderea hemoglobinemiei a hematocritului si a trombocitelor. Animalele sfarsesc prin moarte.

b)       Forma timica - (limfomul timic) apare la animalele de 6-30 luni si se caracterizeaza prin aparitia unei tumori in regiunea latero - inferioara gatului cu tulburari functionale (dispnee, staza jugulara ce duc la moarte rapida).

c)        Forma cutanata -( limfomul cutanat) - se intalneste la animalele de 6 luni - 4 ani. Se caracterizeaza prin aparitia de placi urticariforme cu un diametru de 3-4 cm la nivelul gatului si regiunilor umarului concomitent cu hipertrofia limfonodurilor.

Tablou morfopatologic:

Modificarile mai importante constau in procese difuze sau modulare, hiperplazie tumorala, la nivelul organelor hematopoetice dar si in viscere. Organele sunt marite in volum, devin friabile, iar pe sectiune se distinge un tesut omogen uneori presarat cu insule de necroza galbene-maronii.

Diagnosticul: - se stabileste pe baza datelor epidemiologice, aspectele clinice, datelor morfopatologice si examenului de laborator. Diagnosticul de rutina este examenul serologic.

Diagnosticul diferential:

fata de starile inflamatorii care antreneaza leucocitoza (mamite, metrite, nefrite)

boli infectioase (tuberculoza, bruceloza)

boli parazitare (fascioloza, babesioza)

-tumori neleucozice (sarcoame, carcinoame, adenoame)
Prognosticul - este grav.

Profilaxie si combatere

Se bazeaza numai pe masuri generale:

prevenirea introducerii bolii in tara si in efectivele indemne

examen serologic cu 30 zile inainte de imbarcare

se impun examene clinice periodice la toate bovinele

controlul serologic prin ID la toate bovinele peste 6 luni.

Pe baza rezultatelor examenelor efectivele de bovine se impart in :

suspecti de LEB

efective contaminate de LEB

efective libere de LEB

CAPITOLUL II

MODIFICARI ALE PROFILULUI IMUNOLOGIC LA BOVINELE INFECTATE CU VIRUS LEB

Din punct de vedere al evenimentelor patogenetice contactul virusului leucozei bovine cu organismul, determina aparitia a trei categorii de modificari dupa cum urmeaza:

a)        modificari ce privesc structura si functia virusului cauzal;

b)        modificari a imunitatii mediate celular si umoral;

c)        modificari ale 'supravegherii imune' cu declansarea unei reactii de tipul 'grefa contra grefa' cu exprimare leucemica si tumorala.

a)Modificari ce privesc virusul cauzal

Virusul leucozei bovine are o istorie naturala recenta, cresterea patogenitatii fiind legata de pasajul accelerat de miscarile mari de bovine. Punerea in evidenta cu ajutorul anticorpilor monoclonali a unui numar de 8 epitropi, notati cu litere de la A la H fata de numai 2 cati au fost caracterizati cu ajutorul testului de ID in gel de agar (p 24, gp 58) demonstreaza ca aparitia mutatiilor punctiforme este posibila.

Virusul leucozei bovine este lipsit de gena 'onc' valentele patogene fiind date de activitatea genelor 'tox' si 'rex' cu potential activator asupra leuconogenezei limfocitelor si transformarea acestora in celule 'nemuritoare'. Deasemenea, pentru activarea replicarii nu necesita asocierea cu virus 'helper' si nici nu au echivalent la nivelul oncogenelor celulare. Poate actiona in oncogeneza indirect dupa activarea oncogenei H - ras, prezent in genomul uman dupa cum a fost demonstrata recent.

b)Modificarile profilului imunologic

Capacitatea de aparare a organismului prin mijloace dobandite se realizeaza prin mecanisme umorale si celulare, dar in cursul evolutiei procesului infectios aceste mecanisme de aparare sufera modificari.

Alterari ale imunitatii mediate umoral: anticorpii sunt sintetizati de catre limfocitele B stimulate de antigene in cooperare cu celulele prezentatoare de antigen in limfocitele T; primii anticorpi sunt din clasa IgM iar ulterior IgG si IgA. S-a stabilit ca virusul leucozei bovine are efect blocant la nivelul precursorilor limfocitari in privinta comutarii sintezei anticorpilor; genele responsabile sunt oprite dar la secventele implicate in codificarea IgM.

Alterari ale imunitatii mediate celular: in leucoza enzootica bovina are loc schimbarea raportului limfocite T / limfocite B de la valoarea normala de 2,61 la 0.7 alaturi de blocarea limfocitelor de a mai raspunde la lectine (mitogene: fitohemaglutinina).

Neactivarea functiilor citotoxice in cazul limfocitelor Te si NK este urmata de scaderea rezistentei organismului si multiplicarea virusului iar apoi distrugerea celulei gazda.

2.1. Modificari ale efectorilor imuni umorali

Actiunea exercitata asupra imunitatii mediate umoral a fost sesizata dupa identificarea proprietatii antigenice a p 24 sau gp 58. Acestea pot declansa sinteza de anticorpi de tipul IgM_, IgG si IgA, fata de care placenta vacilor gestante are rol de bariera completa, a apreciat ca virusul leucozei bovine, la nivelul precursorilor limfocitari are efect blocant pentru comutarea sintezei anticorpilor, genele responsabile fiind oprite doar la secventele implicate in codificarea IgM. Din acest punct de vedere, mecanismul etiopatogenetic este apropiat de cel descris in cazul bolii Waldestrom, semnalata la om, caine si pisica. Cercetari aprofundate sunt indreptate in momentul de fata asupra limfokinelor si altor citokine.

Transmiterea bolii se face dominant pe cale orizontala. Un rol favorizant l-a jucat punctionarea directa a venei jugulare, care a directionat antigenele virale in splina, precum si folosirea unor vaccinuri contaminate cu virusul leucozei bovine. Transmiterea pe calea verticala apreciata la un procent de 5 % nu a fost suficient de bine explicata. Integrarea virusului in genomul limfocitelor sub forma de provirus le confera capacitatea contaminanta pentru vitei proveniti din mame infectate in cazul microtraumelor survenite

in timpul fatarii. Deasemenea acestea pot ajunge in materialul tumoral, la taurii bolnavi de leucoza.

0 alta observatie importanta a fost aceea ca la vacile gestante cu 3 saptamani
inainte de fatare si la alte 3 dupa aceea, titrul anticorpilor serici scade (de la 1:1 ta 1:2),
crescand in schimb colostrul (de la 1:8 la 1:28) dar cu toate acestea nu se anuleaza
capacitatea infectanta. Prezenta complexelor antigen-anticorp si a leziunilor de
glomerulonefrita autoimuna fost descoperita la 37 din cele 87 de bovine cercetate.

2.1.a. Modificari ale efectorilor umorali implicati

Complementul - ca si imunoglobulinele - are rol in aparare, dar pentru exercitarea acestui rol este nevoie de un sistem declansator reprezentat de complexul antigen-anticorp si complexul C. Neformarea complexului antigen-anticorp produce blocarea activarii complementului si o slaba reactie din partea organismului la actiunea agentului viral.

Limfokine si monokine

Citokinele secretate de limfocite se numesc limfokine, iar cele secretate de monocite - macrofage monokine. Stiindu-se ca atat limfokinele cat si monokinele au un rol reglator in cresterea si maturarea celulara, neindeplinirea acestor functii duce la un raspuns al sistemului imunitar.

Interferonii reprezinta o serie de proteine, neinrudite intre ele, cu efecte antivirale recunoscute. Exista trei tipuri de interferoni: alfa interferonul, produs de limfocitele T nestimulate si monocite (interferon leucocitar); beta interferonul, produs de celulele epiteliale din organele infectate si de fibroblastii din cultura; gamma interferonul, produs de limfocitele T stimulate (interferonul limfoblastoid). Variatiile activitatii biologice ale interferonilor pot fi grupate in 3 mari categorii:

- actiunea antivirala

- actiunea antitumorala

- actiunea imunoregulatoare

Primul dintre efectele cunoscute ale interferonului, activitatea antivirala, este exprimata prin impiedicarea transmiterii infectiei virale la celulele care au atasat de membrana lor molecule de interferon. Actiunea antitumorala a interferonilor se executa prin activarea celulelor ce intervin in raspunsul imun ca si prin inhibarea diviziunilor celulare, blocand astfel proliferarea celulara. Activitatea de reglare a raspunsului imun se realizeaza in diferite etape, prin influenta exercitata asupra diversilor efectori, atat in vivo cat si in vitro. Urmarind activitatea biologica a interferonilor se apreciaza in mod obisnuit ca unitate, concentratia minima necesara si suficienta pentru a induce rezistenta fata de un efect viral masurabil (de exemplu formarea de plagi hemoglutinare). Se utilizeaza in acest scop indeosebi virusuri din familia Togaviridae, extrem de sensibile la actiunea interferonului. Interferonii influenteaza in sens negativ mitozele celulare, efect dozabil in culturi limfocitare.

Capacitatea inhibitoare a interferonului alfa in culturile de limfocite stimulate cu PHA este dependenta de momentul ciclului celular si de sensibilitatea limfocitelor T fata de interferon, sensibilitate ce difera de la individ la individ.

2.2. Influenta infectiei cu virus LEB asupra efectorilor imuni celulari

In ce priveste imunitatea mediata celular, schimbarea raportului limfocite T / limfocite B, de la valoarea normala de 2,61 la 0,7 in leucoza, alaturi de blocarea limfocitelor de a mai raspunde la lectine mitogene (fitohemoglutinina, concanavalina A) a fost descrisa de multi autori.

Taylor in 1992 a descris primele modificari care au loc in leucoza bovina in cazul subclaselor limfocitare T si B. Raportul Bo - CD 4 / Bo - CD 8 se modifica de la 2,1 care corespunde starii de sanatate, la 1,4 ani in limfoleucoza persistenta si 1,5 in cazul celor seroconverse. Reducerea competentei imune explica cauza pierderilor de bovine in fermele contaminate, puse pe seama leziunilor virale, bacteriene sau micotice recunoscute ca si infectii oportuniste numai in cazul imunodeficientei bovine.

In afara de limfocite, se recunosc ca fiind implicate macrofagele 'armate', limfocitele T citotoxice, celulele NK, Killer, descrise si la bovinele cu leucoza.

Existenta unei interrelatii intre imunitatea mediata umoral si celular s-a vazut si in cazul leucozei bovine, cand anticorpii specifici provoaca ascunderea receptorilor antigenici de pe suprafata limfocitelor infectate, fenomen asociat cu micsorarea sau oprirea replicarii virusului pe timpul in care acesta actioneaza. O celula infectata cu virusul leucozei bovine poate constitui suportul replicarii virusului cauzal, proces confirmat de prezenta pe suprafata acestuia a antigenelor asociate virusului cauzal. Antigenul BOCMA a fost identificat de Onuma (197HS) si este echivalentul antigenelor COC AL si FOCMA, descrisi la leucemiile aviare si feline. In afara de acestea, implicarea genelor tox si rex pe calea activarii leucenogenezei si transformarii limfocitelor in nemuritoare declanseaza transformarea maligna.

2.3. Modificari legate de alterarea supravegheri imune

In acest caz are loc instalarea unei reactii de tipul grefa contra gazda, exprimata prin aparitia leucemiei si bolii tumorale.

In mod normal, organismul bovin are capacitatea sa recunoasca celulele cancerizate din organism, aparute in urma infectiei cu retrovirusuri oncogene, activarii unor oncogene celulare (Ha-ros) sau ca efect al unor mutatii a caror cauza este mai putin cunoscuta. Acest proces a fost descris sub numele de 'supraveghere imuna' eficienta in cazul leucozei bovine atunci cand antigenele virale apar pe suprafata limfocitelor predestinate sa le recunoasca, ca antigene asociate (Tumaurs^´ Viral Associated Antigens).

In anul 1993 a fost identificata pe suprafata limfocitelor provenite de la bovine cu limfosarcom, cu ajutorul anticorpilor monoclonali, prezenta altor antigene care sunt asociate numai procesului tumoral. Prezente atat pe suprafata celulelor, cat si in citoplasma, acestea sunt diferite de TAVA, fiind denumite 'Tumor Associated' (TAA). Aceste antigene au putut fi gasite pe suprafata limfocitelor leucemice, inainte de aparitia semnelor clinice caracteristice. Dupa izolarea si caracterizarea biochimica precum si a antigenitatii s-a vazut ca au proprietati blastizante asupra limfocitelor infectate de virusul leucozei bovine, lucru care nu se intampla la animalele sanatoase. Limfocitele afectate sunt de tipul B. Asupra celulelor tumorale in culturi celulare exercita efect supresor, fapt ce explica 'in vivo' aparitia starilor de liniste pasagera in evolutia bolii.

Un alt aspect legat de patogeneza l-a reprezentat urmarirea in timp prin testul ID in gel de agar a comportamentului anticorpilor formati fata de cele doua antigene majore, p 24 (intern) si gp 58 (extern).

CAPITOLUL III

TUBERCULOZA

Generalitati

Tuberculoza este una din cele mai vechi si mai grave boli ale omului si animalelor. In 1882 Robot Kock descopera agentul etiologic al bolii, iar in 1890 prepara tuberculina.

Tuberculoza la bovine este mai frecventa in tarile in care se practica cresterea intensiva in marile unitati, cu precadere la animalele cu mare randament, si mai cu seama la vacile cu productii mari de lapte.

Infectia tuberculoasa, provoaca pierderi economice insemnate mai ales la bovine prin: confiscari ale carnii si organelor, scaderea randamentului la taiere in medie cu 10 % fata de animalele sanatoase, scaderea productiei de lapte cu 12 % fata de productia normala.

Tuberculoza la mamifere este produsa de germeni din genul Mycobacterium iar la bovine de specia Mycobacterium tuberculosis var bovis.

Din punct de vedere antigenic structura micobacteriilor este foarte complexa si eterogena. Pe langa fractiunile antigenice proprii fiecare specie dispune de antigeni comuni ('coalergeni') care sunt capabili sa genereze stari de sensibilizare alergica fata de tipurile cardinale (reactii paraalergice) (sensibilizare tuberculinica).

Din punct de vedere morfologic, agentii etiologici ai tuberculozei sunt germeni alcalo-, alcoolo-, acidorezistenti, de forma bacilara mai rar cocobacilara, Gram-pozitivi.

Rezistenta bacilului tuberculozei este mult mai mare comparativ cu alte specii nesporulate datorita structurii chimice, in special a invelisului cero-lipidic.

Receptivitate: Se intalneste la om si la numeroase specii de mamifere si pasari domestice si salbatice. In ordinea descrescanda a sensibilitatii pe primul plan se situeaza omul urmat de taurine, suine, galinacee, carnivore, caprine, solipede si ovine.

Tabloul clinic: Perioada de incubatie este lunga, depasind uneori 3-4 saptamani, evoluand de obicei cronic, forma acuta fiind rara.

Forma acuta debuteaza cu sindrom de febra grava insotit de tulburari organice variate. Astfel in tuberculoza miliara se intalnesc manifestari generale grave de septicemie, pot apare si tulburari respiratorii (dispnee, tuse scurta si dureroasa).

Forma cronica se produc o serie de tulburari functionale in raport cu localizarea proceselor specifice.

a)        Localizarea pulmonara - cea mai frecventa - manifestata prin tuse care la inceput este slaba, scurta, uscata care se declanseaza atunci cand animalele fac miscari bruste. In fazele avansate apar si tulburari generale: exprimate prin pierderea treptata a puterii de munca, slabire, anemie.

b)        Localizarea pleurala si pericardica - tradusa prin frecatura pleurala sau pericardica apoi maritate si diminuarea zgomotelor ascultatorii.

c)        Localizarea digestiva - se constata colici periodice, constipatie alternand cu diaree, apetit capricios.

d)        Localizarea mamara - afecteaza mai frecvent sferturile posterioare si consta in marirea in volum aparand mamelonat indurat si nedureros, tesutul glandular se atrofiaza si dispare progresiv.

Tuberculoza ganglionara - cei mai afectati sunt ganglionii retrofaringieni, prescapulari, precrurali, ei apar mariti in volum, sunt duri, mobili sub piele, mamelonati si insensibili.

Modificari morfopatologice:

Se pot gasi simple leziuni congestivohemoragice nespecifice, noduli de diferite dimensiuni, cazeificati, calcificati, inconjurati de o capsula conjunctiva bine organizata - leziuni cu aspect sarcomatos, bronhopneumonie, limfadinita modulara.

Diagnostic

Se stabileste prin colaborarea datelor epizootologice, clinice, alergice si anatomopatologice si a rezultatelor de laborator. Examenul alergic constituie metoda obisnuita de diagnostic; el se bazeaza pe punerea in evidenta a starii de alergie prin doua procedee: 'testul unic' (T.U.) cunoscut si sub denumirea de tuberculinare intradermica simpla si 'testul comparativ simultan' (T.C.S.)

Prognostic - Este defavorabil datorita dirijarii animalelor obligatoriu spre abator.

Tratament - desi ale posibil de efectuat, dar nu se practica.

Profilaxie si combatere

animalele nou achizitionate trebuie insotite de certificatul SV care atesta indemnitatea efectivului si se testeaza sub raportul tuberculozei in perioada de carantina profilactica

in cazul aparitiei tuberculozei se declara oficial boala si se instituie masuri de carantina de gradul III

animalele infectate se dirijeaza la abator

stingerea bolii si ridicarea masurilor de carantina se face dupa un an de la eliminarea sau de la moartea ultimului animal bolnav si dupa ce s-a efectuat dezinfectia finala.

CAPITOLUL IV

PERTURBARI ALE ACTIVITATII IMUNE IN CONDITII DE HIPERSENSIBILIZARE TUBERCULINICA

Imunitatea in tuberculoza este naturala sau dobandita, aceasta din urma, fie ca o consecinta a unei infectii din mediu cu bacili tuberculosi virulenti care nu au dus la imbolnavire, fie indusa in mod artificial prin vaccinare BCG (cu germeni de tip bovin atenuati, nevirulenti si nepatogeni, dar cu capacitatea imunogenetica pastrata).

Dupa cum s-a dovedit prin experimentul clasic ''fenomenul Koch' starea de hipersensibilitate de tip intarziat si starea de imunitate au aceeasi cauza si se produc aproape concomitent, fiind considerate aproape unanim ca doua fatete ale aceluiasi fenomen.

Este unanim admis, ca hipersensibilitatea intarziata de tip tuberculinic, cat si imunitatea antituberculoasa, au substrat celular (sunt tipuri de raspuns imunitar mediate celular).

Astfel, induratia produsa prin injectarea tuberculinei la un individ infectat cu BK este constituita in esenta dintr-o infiltratie masiva cu limfocite si macrofage sensibilizate anterior, de contactul BK (celule imunocompetente - deci capabile sa declanseze un raspuns imunitar.

Hipersensibilizarea de tip intarziat este un raspuns inflamator accelerat care are adesea efect daunator asupra tesuturilor gazda in special atunci cand concentratiile locale de antigeni tuberculari like sunt inalte. Acest raspuns produce necroza cazeoasa de lichefiere. Lezarea pulmonara apare astfel ca fiind aproape integral cauzata de hipersensibilitatea intarziata.

4.1. Efectori imuni umorali implicati. Metode de evidentiere

Confruntarea permanenta a microorganismului cu bacteriile, virusurile, micetii din mediul inconjurator, efortul sau de a le inlatura pe cele cu actiune nociva a dus la elaborarea unor mecanisme de aparare grupate sub denumirea de rezistenta (imunitate) naturala. Elementele esentiale ale acesteia sunt: barierele anatomice, sistemele fagocitare micro si macrofagic (leucocite, neutrofile, monocite) si mecanismele efectoare umorale (de tipul complementului). Toate aceste structuri sunt supuse influentelor reglatoare genetice, (CMH) neuroendocrine, nutritionale. Exista corelatii stranse intre mecanismele locale si sistemice, nespecifice si specifice umorale si celulare.

Activarea functiei fagocitare in procesul de chimiotoxie si opsonizare, implica cresterea rolului factorilor umorali ai imunitatii sistemice. In acest cadru trebuie mentionata interventia lizozimului complementului, properdinei, polipeptidelor bazice, beta lizinei, opsoninelor si diversilor anticorpi naturali. Cu toate ca parerile legate de incadrarea interferonilor in categoria de efectori aferenti imunitatii nespecifice sunt contradictorii, o serie de considerente (coparticiparea la numeroase procese, lipsa de specificitate a reactiilor fata de non-self) justifica catalogarea lor in aceasta clasa.

A fost sugerata si aplicata cuantificarea acestor efectori umorali prin tehnici de complexitati diferite in scopul evaluarii nivelului statusului reactivitatii naturale a organismului.

4.1.1. Lizozimul

Lizozimul (N acetil - muramil - hidrolaza) este o carbohidroza care desface selectiv legaturile glicozidice (1-4) intre acidul N -acetil muraminic si N - acetil glucozamina, elemente ce intra in componenta peptidogliconului din peretele bacterian. Distrugerea mureinei determina dezechilibre de presiune osmotica intre interiorul si exteriorul celulei bacteriene facilitand distrugerea ei.

Sensibilitatea deosebita a unor bacterii din genul Micrococcus fata de actiunea lizozimului a stat la baza utilizarii acestora pentru aprecierea capacitatii litice a enzimei prin metode fluorimetrice, difuzimetrice sau spectrofotometrice.

4.1.2. Complementul

Sistemul complement reprezinta un mijloc efector major in cadrul procesului inflamator, cu efect de opsonizare a microorganismelor si complexelor imune, activarea fagocitelor (macrofage, neutrofile) si liza celulelor tinta.

Evaluarea activitatii sistemului complement s-a realizat prin utilizarea unor teste de hemoliza, teste imuno-chimice si de consum.

Detectarea si aprecierea cantitativa a componentelor individuale poate relaxa nivelul total sau nivelul functional al acestora, in primul caz se pot aplica tehnici radioimunologice sau imunoenzimatice, iar in al doilea caz se urmareste exprimarea capacitatii functionale, hemolitice, a unei componente oarecare a complementului intr-o suspensie de hematii, la care au fost adaugate toate elementele constitutive ale sistemului complement, cu exceptia celei studiate.

4.1.3. Properdina

Activitatea properdinei in organism este dificil de separat de aceea a complementului. A fost descrisa participarea properdinei prin cele cinci componente A,B,D,E si P in activarea pe cale clasica si/sau alternativa a complementului.

Properdina intervine in distrugerea a o serie de bacterii, indeosebi Gram negative, a unor bacteriofagi si are probabil rol anticanceros. Concentratia sa poate reprezenta un parametru al nivelului reactivitatii imunologice naturale.

4.2. Efectori imuni celulari implicati

Fagocitele polimorfonucleare (granulocite, microfagele)

Functia fagocitara reprezinta una dintre laturile importante ale protectiei antiinfectioase. Microfagele intervin la poarta de intrare a 'agresorilor' reprezentand unele dintre primele 'arme" celulare protectoare. Ele actioneaza prin fagocitarea si distrugerea microorganismelor decelate.

Testarea capacitatii functionale a neutrofilelor poate elucida suspiciunea de imunodeficit neutrofilic primar, daca se coreleaza cu alte teste pentru depistarea unor imunodeficite mai frecvent intalnite.

Deficitele neutrofilice secundare sunt foarte frecvente, consecinta unor alte boli. Testele functionale pot depista in acest caz, alterari intervenite in diferitele etape ale procesului fagocitar: chemotaxia, interactiunea cu particule opsonizante, ingestia acestor particule, dezvoltarea suntului respirator, distrugerea si digerarea microorganismelor.

Fagocite mononucleare

Efectul principal al sistemului fagocitar mononuclear este celula macrofagica provenita din monocitul care paraseste circulatia si se fixeaza in tesuturi formand histiocitele (macrofagele alveolare in pulmoni, celulele Kuppfer din ficat, macrofagele sinusale din splina, ganglionii limfatici etc).

Un rol important in dirijarea apararii tisulare contra bacililor tuberculosi il are macrofagul. Astfel 'batalia' poate avea un final favorabil gazdei, daca la sediul gazdei sunt atrase repede din circulatie suficient de multe celule mononucleare, daca aici se convertesc rapid in macrofage activate si prin intermediul limfokinelor in limfocite, sensibilizate, imunocompetente.

Transformarea in macrofage tisulare este insotita de o crestere in volum, activarea metabolismului, sporirea receptivitatii fata de activarea limfocitara si a capacitatii fagocitare. Mecanismele chemotactice prin care macrofagele sunt atrase la locul agresiunii sunt mai putin cunoscute decat cele implicate in activitatea neutrofilelor.

Efecte chemotactice exercita asupra macrofagelor componenta C5, a complementului, si o serie de produse secretate de limfocitele T (MIF - factor de inhibare a migrarii).

Opsonizarea pare a se desfasura similar cu aceea din cazul neutrofilelor, fiind prezenti receptori F si C.

Ingestia si distrugerea microbiana este mai putin eficienta decat cea neutrofilica, iar caile metabolice depind de fosforilarea oxidativa.

Se stie ca in afara de macrofage (care fagociteaza si distrug bacilii), al doilea element tisular responsabil de imunitatea antituberculoasa este necroza cazeoasa; in cazeumul solid bacilii sunt distrusi in numar foarte mare (raspuns tisular favorabil gazdei), in schimb din momentul ramolirii si lichefierii cazeumului incepe o multiplicare bacilara foarte intensa (raspuns tisular nefavorabil gazdei)

Ramane esentiala pentru toata evolutia ulterioara a infectiei si a bolii tuberculoase, interrelatia permanenta de conditionare reciproca intre hipersensibilitatea de tip intarziat (alergia tuberculinica) si imunitatea dobandita in urma contactului cu BK.

Hipersensibilitatea intarziata din tuberculoza poate fi definita ca un proces care distruge macrofagele neactivate in care bacilii tuberculosi se multiplica, similar, imunitatea mediata celular se defineste ca un proces in care macrofagele activate omoara si digera bacilii pe care i-au incorporat.

In ambele situatii se poate stopa multiplicarea bacililor tuberculosi pentru ca in macrofagele moarte, care reprezinta o componenta majora a tesutului de necroza cazeoasa solida, acestia nu mai au posibilitatea de a se multiplica.

In ambele tipuri de raspuns hipersensibilitatea de tip intarziat si imunitatea celulara - antigenii specifici locali stimuleaza limfocitele T sa produca limfokine care atrag si activeaza macrofagele si limfocitele aditionate.

Principala diferenta intre hipersensibilitatea intarziata si imunitatea mediata celular din tuberculoza, este ca prima actioneaza prin bacili care omoara macrofagele neactivate, iar a doua prin amplificarea macrofagelor de a omori bacilii pe care i-au ingerat.

Rolul macrofagelor este insa extrem de important in procesarea si exprimarea pe suprafata lor celulara a antigenelor microbiene.

CAPITOLUL V

METODE DE DOZARE A CONCENTRATIEI DE IgG CIRCULANTE

5.1. Difuzia simpla bidimensionala (Imunodifuzia radiala simpla - Testul Mancini)

Aceasta metoda se bazeaza pe difuzia radiala a antigenului intr-un gel ce contine o cantitate constanta de anticorpi monospecifici. Diametrele zonelor circulare de precipitare sunt direct proportionale cu concentratia antigenului ce difuzeaza si invers proportionala cu concentratia anticorpilor si inaltimea stratului de gel in care sunt inglobati anticorpii.

Pentru a obtine o marime convenabila a zonelor de precipitare si un contur bine delimitat al acestora, concentratia anticorpilor inglobati in gel trebuie aleasa in functie de titrul antiserului si nivelul concentratiei antigenului testat Cantitatea de antigen introdusa in godeuri trebuie sa depaseasca capacitatea de legare a anticorpilor inglobati: in cazul unor proteine concentrate fiind necesara diluarea lor.

Pentru determinarea cantitativa a unor Ig si a altor componenti serici, institutele specializate livreaza imunoplaci standard insotite de tabele in care sunt trecute valorile proteinelor respective, ceea ce permite o interpretare rapida.

Deasemenea, prin aceasta metoda cuantificandu-se concentratia diferitelor clase de imunoglobuline, ea reprezinta un element util in definirea profilului imunofiziologic.

IDRS (imunograma) este esentiala in cazul diagnosticarii imunodeficientelor primare si secundare si testarea valorii antigenice a unor produse biologice.

5.2. Imunoelectroforeza

Aceasta tehnica imbina separarea antigenelor in functie de incarcatura lor electrica, cu dubla difuziune, avand ca rezultat formarea unor arcuri de precipitare specifice.

Prin imunelectroforeza se realizeaza:

separarea si determinarea numarului de constituienti dintr-un amestec de antigene

definirea antigenelor pe baza mobilitatii electroforetice

- izolarea din gel a antigenului urmarit pentru a realiza o analiza
imunochimica mai amanuntita sau pentru a obtine seruri monospecifice.

Reactia se desfasoara in doua etape:

Separarea fractiunilor antigenice dintr-un complex prin migrare in camp electric;

Punerea in contact cu sursa de anticorpi, in vederea formarii de complexe antigen-anticorp si formarea arcurilor de precipitare.

Dintre toate metodele de imunodifuzie, IEF are cea mai mare capacitate de rezolutie. Concentratia proteica a amestecului supus analizei trebuie sa fie cat mai mare pentru a putea evidentia componente care se gasesc intr-o concentratie scazuta,

5.3. Anticorpi monoclonali

Anticorpii monoclonali sunt imunoglobuline secretate de una si aceeasi clona plasmocitara. Sinteza anticorpilor monoclonali este realizata 'in vitro' de 'hibridoma', hibrizi celulari constituiti din fuziunea unui limfocit B si a unei celule tumorale. Hibridoamele intrunesc calitatile celulei tumorale (imortalitatea) si cele ale limfocitului B (secretia unei imunoglobuline dirijate impotriva unui anumit epitrop).

In cazul imunizarii naturale sau artificiale mai multe limfocite B se transforma in limfoblaste, se multiplica, apoi se diferentiaza pentru a da nastere la mai multe clone de plasmocite. Serul imun rezultat va fi deci policlonal eterogen. Izolarea unei singure clone plasmocitare si cultivarea sa in vitro vor determina aparitia in mediul de cultura a unui singur tip de anticorpi, care recunosc un singur determinant de pe suprafata antigenului folosit.

Plasmocitele izolate, la fel ca toate celulele normale, imbatranesc si mor dupa cateva cicluri de multiplicare, anticorpii obtinuti fiind in cantitate neinsemnata. Evitarea acestui neajuns a dus la elaborarea tehnicii de sinteza a anticorpilor monoclonali.

a) Protocolul de obtinere

Limfocitele B izolate de la un animal imunizat sunt fuzionate in vitro cu celule canceroase. Hibrizii formati sunt izolati de celule nefuzionate, apoi va fi selectionat acel hibridom care produce anticorpii doriti.

b) A le ger ea celulelor parentale

Hibrizii celulari pierd frecvent o parte din materialul cromozomial. Aceasta instabilitate genetica este cu atat mai mare cu cat celulele parentale provin de la specii mai indepartate filogenetic. Acesta este motivul pentru care hibridoamele se constituie din celule provenind de la aceeasi specie sau de la specii apropiate: soarece - soarece, sobolan - sobolan, om - om. Pentru o buna sinteza de imunoglobuline se recomanda deasemenea ca fuziunea sa fie facuta intre un limfocit B si un limfocit B tumoral, adica o celula mielomatoasa (leucemica).

Sursa de limfocite B este reprezentata de celulele splenice sau ganglionare ale unui animal hiperimunizat cu antigenul fata de care dorim sa obtinem anticorpii monoclonali.

Alegerea celulei mielomatoase este mai delicata deoarece o parte dintre acestea produc ele insele anticorpi si astfel hibridomul va elibera un amestec de anticorpi. Pentru a se evita acest impediment, se vor folosi celule mielomatoase care si-au pierdut capacitatea de a sintetiza imunoglobuline. Celulele mielomatoase utilizate trebuie sa aiba in plus o deficienta enzimatica, a carei importanta va fi relevata in continuare.

c) Fuziunea celulara

Fuziunea celulara necesita un agent de fuziune. Primul agent de fuziune a fost virusul Sendai (Paramyxoviridae) care prezinta spiculi ce introduc fuziunea membranelor celulare. Unii agenti chimici, cum ar fi polietilenglicolul (P.E.G.) poseda aceeasi proprietate si da rezultate reproductibile. Dupa fuziune, populatia celulara este constituita din celule splenice nefuzionate, celule mielomatoase nefuzionate si celule fuzionate.

d)Eliminarea celulelor mielomatoase

nefuzionate se realizeaza usor deoarece aceste celule nu supravietuiesc in vitro mai mult de cateva zile. (Eliminarea celulelor mielomatoase nefuzionate se face printr-un artificiu.)

e) Productia de anticorpi monoclonali

Dupa selectarea clonelor 'fertile' o parte din hibridoame este conservata prin congelare in azot lichid, constituind fondul de rezerva, iar alta parte va fi folosita la producerea anticorpilor monoclonali. Productia poate fi realizata in vitro sau in vivo.

Pentru productia in vitro se va recolta superlatantul culturii de celule in urma fiecarui ciclu de multiplicare si din aceasta se vor purifica anticorpii. Productia in vivo se realizeaza injectand hibridoamele pe cale intraperitoneala la animale de experienta. Fiecare hibridom grefat pe peritoneu sau mezenter va forma o tumora iar in lichidul ascitic vor apare anticorpi monoclonali.

f) Avantajele anticorpilor monoclonali

anticorpii monoclonali sunt dotati cu o specificitate de recunoastere foarte exacta

se pot obtine in cantitate infinita avand caracteristici constante

sunt folositi la constituirea unor banci de reactivi standardizati servind la activitatea de diagnostic: (serurile policlonale au calitate variabila in functie de animalul folosit pentru producerea lor)

-releva diferente minore dintre antigene, insesizabile prin folosirea serurilor clasice ( de exemplu, a fost demonstrata prezenta unor surse diferite de virus rabic. Descoperirea a oferit suportul stiintific observatiilor ca vaccinul pasteurian nu confera intotdeauna imunitate fata de virusul sud-american vehiculat de vampiri.)

Folosind anticorpii monoclonali pot fi deosebite diferitele clase de limfocite T_, diferentiere utila pentru diagnostic si alegerea conduitei terapeutice adecvate in unele boli imune la om.

Se tinde spre inlocuirea serurilor clasice folosite in profilaxie de catre anticorpi monoclonali.

5.4 Imunofluorescenta

Imunofluorescenta se bazeaza pe observarea microscopica in lumina ultravioleta (uv) a reactiilor antigen-anticorp, care devin vizibile atunci cand anticorpii sunt marcati cu o substanta fluorescenta. Astfel de substante se numesc fluorocromi.

Antigenele corpusculare (bacterii, virusuri, paraziti, celule etc) devin observabile in urma absorbtiei anticorpilor specifici fluorescenti, imaginea microscopica reproducand morfologia substratului respectiv. In cazul antigenelor moleculare (toxine, extracte etc) pentru a putea forma cupluri antigen-anticorpi vizibile in spectru (uv) aceasta trebuie in prealabil absorbita pe un suport corpuscular (hematii, carbuni etc).

Anticorpii marcati cu substante fluorescente constituie materialul cel mai important in imunofluorescenta, de calitatea lor depinzand fidelitatea rezultatelor.

Dintre numeroasele substante fluorescente cunoscute, calitatile de mai sus sunt indeplinite de izotiacianatul de fluoresceina, fluorescamina si rodamina B-200.

Serurile specifice se obtin prin hiperimunizarea animalelor de laborator cu antigenele corespunzatoare a caror identitate este urmarita prin imunofluorescenta. Titrul de anticorpi al acestor seruri trebuie sa fie ridicat si sa aiba o specificitate stricta. Marcarea cu fluorocrom a serurilor integrale prezinta o serie de inconveniente, motiv pentru care se recomanda marcarea imunoglobulinelor purificate.

Metoda se bazeaza pe conjugarea chimica a anticorpilor cu anumite substante care au proprietatea de a fi fluorescente in cazul iradierii in lumina ultravioleta.

La ora actuala se practica doua metode de IF: varianta directa si cea indirecta.

Metoda directa este mai usor de efectuat dar prezinta urmatoarele dezavantaje: seruri concentrate, seruri specifice.

Avantajul metodei indirecte consta in faptul ca, avand un singur ser antiglobulinic fluorescent de specie, aceasta se poate utiliza pentru identificarea oricarui antigen pentru care exista seruri specifice nemarcate (anticorpi).

5.5. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sarbent Assay)

Metode imunoenzimatice

Tehnica reprezinta un lant de reactii in care primul reactant (antigenul sau anticorpul in functie de scopul urmarit) este imobilizat pe un suport solid. Al doilea reactant al lantului se leaga de elementul fix, in teza specificitatii dintre antigen si anticorp. Complexul format cupleaza cel de-al treilea reactant marcat enzimatic tot printr-o reactie antigen - anticorp.

Pe baza acestui principiu s-au realizat o serie de variante axate pe doua directii:

a)        metoda indirecta pentru determinarea anticorpilor

b)        metoda directa

c)        metoda dublu sandwich pentru determinarea antigenelor

Antigenul folosit in reactie este reprezentat de o suspensie bacteriana sau virala, componente solubile ale acestora sau ale unor paraziti. Se utilizeaza de obicei extracte brute avand capacitatea de a se fixa pe suprafete solide prin absorbtia fizica sau legare covalenta.

Mediul de reactie este o solutie tampon care poate avea compozitii diferite. Alegerea concentratiei optime de antigen se realizeaza prin testari in 'tabla de sah' comparativ cu un ser pozitiv si un ser negativ.

Anticorpii utilizati in diferite variante ale testului pot fi: anticorpi fata de antigenul a carui eventuala prezenta este listata si a carui concentratie se determina; anticorpi fata de imunoglobuline (totale sau clase ale acestora) speciei de animale la care se aplica testul in scopul decelarii anticorpilor indusi de un anumit agent etiologic.

Enzimele care pot fi folosite pentru acest test trebuie sa fie detectabile in cantitati foarte mici si sa prezinte o activitate dozabila. Astfel de enzime sunt: peroxidaza, fosfataza alcalina, glucozoxidaza si beta-galactozidaza.

Avantajele metodei ELISA:

nu utilizeaza substante radioactive nocive, care sa necesite masuratori speciale

conjugatul enzimatic se poate pastra, dependent de natura lui, intre 6 luni (Ia+4° C) si 3 ani (la-20° C)

citirile se pot face rapid cu un echipament uzual

metoda este sensibila, rapida si reproductiva

Tehnica poate fi utilizata deasemenea pentru determinarea unor fractiuni proteice, glicoproteinele tumorale, autoanticorpi, anticorpi antinucleari, complexe imune, anticorpi anti - alergici.

PARTEA A -II a

CERCETARI PROPRII

SCOPUL LUCRARII

Studiul componentelor sistemului imun si a interventiei acestora in asigurarea homeostaziei organismelor supuse influentei nocive a factorilor de mediu extern si/sau intern reprezinta la ora actuala un deziderat insemnat. Integritatea structurala a organelor imunocompetente ca si a cailor de raspuns imunologic postagresional constituie o conditie 'sine qua non' a supravietuirii indivizilor si a speciilor.

Virusul leucozei enzootice bovine cu tropism pentru organele limfoide produce modificari in morfologia si in consecinta in activitatea sistemului imun. Cu toate ca evolutia ei e lenta, diminuarea capacitatii reactive si sensibilitatea (receptivitatea) crescuta a animalelor fata de alte boli duce inevitabil spre exitus.

Tuberculoza 'bacterioza intracelulara cronica' persista, progreseaza, poate induce reacutizari, atunci cand organismul este prejudiciat in potentialul sau de riposta.

Investigarea modificarilor survenite la nivelul efectorilor umorali si celulari permite evaluarea in dinamica a procesului morbid si exprimarea cat mai corecta a prognozei.

Lucrarea a urmarit in etape distincte evolutia concentratiei imunoglobulinei G circulante la bovinele din doua unitati: una in leucoza declarata, iar cealalta in asanare pentru tuberculoza, animalele prezentand diferite grade de pozitivitati respectiv hiperreactivitate cutanata.

Au fost evaluate nu numai fluctuatiile acestui efector ci si posibilitatile de augumentare a eficacitatii sale protectoare prin studiul interreactiei cu un ser anti IgG bovin in prezenta unor extracte vegetale. Scopul acestui studiu a fost acela de a vedea in ce masura exista posibilitatea amplificarii eficientei functionale a IgG de catre unele principii naturale continute in extractele respective.

Cu toate ca la animale interventia terapeutica in afectiunile mentionate, o data diagnosticate nu isi justifica economic eficienta, cunoasterea influentei benefice a acestor extracte isi poate gasi aplicabilitatea chiar preventiv, in situatii de necesitate. Fara a intra in detalii biochimice rezultatele pot servi la monitorizarea modificarilor IgG bovin si a posibilitatilor de influentare pozitiva a acestora.

CAPITOLUL I

MATERIAL BIOLOGIC

Probe biologice

Probele au provenit de la animale din trei efective de bovine, situate in Biharia (leucoza enzootica bovina), in Lunca Mures (tuberculoza) si in Bologa bovine (animale sanatoase).

Ferma din Biharia poseda un efectiv de 529 capete. Boala a fost declarata in 1986. Initial confirmarea a fost facuta hematologic iar apoi serologic. Dupa stabilirea fara echivoc a diagnosticului s-au impus masuri de asanare prin extractii (abatorizare) cu eliminarea produsilor din efectiv.

Animalele sunt mentinute in adaposturi, legarea fiind facuta in sistem Groubner. Hranirea animalelor s-a facut cu fan de iarba, siloz si coceni de porumb.

Probele au fost recoltate de la bovine adulte de varste diferite. Animalele s-au mentinut in sistem de crestere intensiv pentru productia de lapte.

Din Tab. nr.l reiese ca in urma examenului hematologic executat la probele provenite de la bovine suspecte de leucoza un numar de 4 probe (1,2,3,11) au dat rezultate pozitive, iar restul de 7 negative.

In Tab. nr.2 se observa ca examenul serologic efectuat pe probele provenite din efectivul suspect de leucoza a pus in evidenta urmatoarele; desi totalul de la probele prelucrate la examenul serologic au fost pozitive 5 probe (5,6,7,8,9), negative 2 probe (1 si 2), si slab pozitive 3 probe (3,11,12).

In ferma din Lunca Mures, vacile sunt mentinute in sistem legat pe patru randuri, cap la cap, cu alei de furajare (fiecare alee pentru doua randuri de vaci) largi de 2,5 m. Sistemul de legare al vacilor este Groubner.

Tabel nr. 1 - Rezultatele examenului hematologic la animalele de

provenienta pentru probele LEB pozitive

Tabel nr. 2 - Rezultatele examenului serologic la animalele de provenienta

pentru probele LEB pozitive.

Hranirea vacilor se face cu siloz de porumb, cantitati mici de fan si porumb.

Unitatea respectiva dispune de un efectiv total de 626 capete:

vaci cu lapte

juninci gestante

vitele montate

vitele intre 12-24 luni

vitele intre 6-12 luni

vitele intre 0-6 luni

masculi intre 0-6 luni

masculi intre 6-12 luni

tineret la ingrasat
187 capete

27 capete

26 capete

129 capete

67 capete

31 capete

31 capete

31 capete

103 capete

Tabel nr.3 - Rezultatele testului de tuberculinizare (TU) la efectivul de animale de la care au fost recoltate probe de sange (Lunca Mures)

Legenda; EM - edem moale;

EP - edem pastos;

ED - edem dur;

In Tab. nr.3 se poate observa ca in urma efectuarii testului unic s-a executat cu tuberculina tipul bovin , la cele 10 bovine testate rezultatele au fost urmatoarele:

proba 4 si proba 7 au reactionat cel mai puternic in acest caz diferita de pliu in urma tuberculi narii fiind cea mai mare: 3,4 mm la proba 4 cu EP si 3,8 mm la proba 7, si ambele bovine au fost incadrate in categoria pozitive.

la celelalte bovine testate reactia locala a fost mai slaba, diferenta de pliu avand valori cuprinse intre 1,5 si 3,3 mm, aceste bovine fiind incadrate in categoria recontrol.

Tuberculoza in aceasta unitate a fost diagnosticata si declarata in 1988.

Ferma din Bologa: Efectivul care a reprezentat martorul negativ pentru ambele determinari a fost un efectiv particular din satul Bologa, judetul Cluj (n = 35). Animalele, cu toate ca sunt crescute de catre particulari, provin dintr-o unitate de elita, facand parte din rasa Baltata Romaneasca. Productivitatea acestor animale este mare pentru sectorul particular (15 - 18 1 lapte / zi, dupa prima fatare). Pentru a mentine productiile la acest nivel animalele au fost furajate in conditii similare celor din unitatea de origine, cu fan de calitate buna, concentrate iar silozul a fost inlocuit de sfecla si borhod.

Actiunile de supraveghere si imunoprofilactice efectuate au fost cele prevazute pentru specia respectiva in planul de actiuni SV al localitatii.

Materiale si metode

Pentru prelevarea sangelui animalul a fost in prealabil contentionat. Recoltarea s-a realizat prin punctionarea venei jugulare. Regiunea a fost pregatita prin dezinfectie cu tinctura de iod. S-au folosit ace cu lumen mare si recipiente sterile pentru stocarea materialului biologic (sangele).

Recoltarea s-a facut pe gel coagulant.

Probele pentru ser au fost lasate sa coaguleze la 37° C , 1 ora, dupa care au fost decolate si trecute la frigider 30 minute. Serul rezultat a fost centrifugat la 2500 turatii / minut timp de 10 minute. Serurile au fost separat trecute in fiole sterile si pastrate la congelator la -20° C pana la momentul determinarilor.

CAPITOLUL II

UTILIZAREA METODEI MANCINI PENTRU DOZAREA IgG,

FOLOSIND REACTIVI STANDARD

2.1. Materiale si metoda (Metoda Mancini)

Aceasta metoda se bazeaza pe difuzia radiala a antigenului intr-un fel ce contine o cantitate «instanta de anticorpi monospecifici. Marimea zonelor circulare de precipitare este direct proportionala cu concentratia antigenului ce difuzeaza invers proportional cu concentratia anticorpilor si inaltimea stratului de gel in care sunt inglobati anticorpii.

Pentru a obtine o marime convenabila a zonelor de precipitare si un contur bine delimitat al acestora, concentratia anticorpilor inglobati in gel trebuie aleasa in functie de titrul antiserului si nivelul concentratiei antigenului testat.

Materiale necesare

ser monospecific

gel de agar 2 %: in tampon medinal pH 8,6 forta ionica 0,025

ser de referinta standard cu o concentratie proteica cunoscuta

placi pentru imunodifuzie

perforator cu diametrul de 3,5 mm

micropipete, pipete gradate

rigla pentru citirea rezultatelor

solutie fiziologica salina (Na CI 8,5 °/₀₀)

camera umeda, realizata prin captusirea unui / unor cristalizator cu hartie de filtru umeda si acoperite cu capac

Se topeste agarul prin fierbere intr-o baie de apa dupa care se aduce la temperatura de 50° C si se pastreaza intr-o baie cu temperatura controlata. Cand agarul a ajuns la aceasta temperatura se amesteca cu serul monospecific calculand 0,5 ml la 2 ml gel (se fac tatonari anterioare, pentru a stabili proportia optima). Pe o lama de microscop se toarna urmatorul amestec: 0,5 ml ser anti IgG +1,5 ml tampon + 2ml gel. Se lasa sa se solidifice pe o suprafata perfect orizontala la temperatura camerei. Dupa solidificare se aseaza peste un sablon si se stanteaza godeuri la distante egale intre ele (3 godeuri / lama.)

Rondelele de gel se scot cu un ac prin aspirare. in godeurile imunoplacii se introduc probele de examinat, cate 3,75 microlitri, cu atentie pentru a nu se depune in afin godeurilor mai ales atunci cand depunerea se face cu pipete Pasteur. Lamele se introduc in camera umeda pentru a evita uscarea lor si se tin la temperatura camerei. Citirea se face la 18 - 24 de ore de la incubare, masurand ca rigla diametrul zonelor de precipitare.

Se calculeaza apoi utilizand curba de referinta, continutul in IgG a fiecarei probe.

Daca se constata zone de precipitare difuze, inseamna ca probele au un continut ridicat in proteine si se recomanda repetarea cu probe diluate.

Materiale necesare pentru prepararea agarului

veronal sodic

metiolat de sodiu

apa distilata

recipienti de sticla

pipete de sticla sterile

agar praf.

balanta analitica

acid clorhidric 0,1 N

Tehnica de lucru

Se cantaresc 9 gr. si veronal sodic si 0,2 gr. metiolat de sodiu si se pun intr-un Erlenmayer curat si uscat peste care se pun 65 ml HCI 0,1 N si se completeaza cu apa distilata pana la 1 1, se ajusteaza pH la 8,6. Erlenmayerul se pune in baia de apa calda iar intre timp se cantareste 300 gr, agar si se pun toate in Erlenmayer. Se lasa pe foc pana la topirea completa a agarului. Agarul astfel obtinut se raceste si se depoziteaza la frigider (+4° C) pana la utilizare.

Prepararea solutiei tampon

Solutiile tampon folosite reprezinta un compromis intre concentratia de electrolit si cea compatibila pentru formarea liniilor de precipitare. in general tampoanele folosite au un pH intre 7,5 si 8,6 si o putere ionica de 0,025 - 0,1.

Folosind o concentratie mai mica a tamponului in placi, componentele vor avea o viteza de migrare mai mare decat in cazul concentratiilor egale. Invers, folosind o concentratie mai mare in placi scade viteza de migrare a componentelor

Cele mai folosite solutii tampon sunt pe baza de dietilbarbituorat de sodiu (veronal sodic - mediul).

Efectuarea scarii etalon

Materiale necesare

IgG Bovina LVB    Div of Hiles Laboratories Inc Naperville USA

ser fiziologic - apa deionizata

pipete de sticla sterile si micropipete

- placa cu microgodeuri pentru dilutie
Tehnica de lucru

Flaconul contine 100 mg IgG bovin liofilizat, s-a realizat dilutia la 50 mg cu 2 ml apa deionizata.

Dupa diluarea imunoglobulinei, cu ajutorul unei micropipete se repartizeaza cate 50 yl ser fiziologic in godeurile placii pentru dilutie in atatea godeuri cate dilutii vrem sa efectuam (6 godeuri).

Apoi, cu aceeasi micropipeta se introduc 50 microlitri din solutia de imunoglobulina de 50 mg in primul godeu. Urmatorul pas este transferarea din primul godeu dupa omogenizarea (prin aspirarea de cateva ori cu pipeta) a 50 microlitri in godeul urmator - operatia repetandu-se pana la godeul 6 cand, cantitatea excedenta de 50 yl se indeparteaza. Vom obtine astfel concentratii diferite de IgG care ne ajuta la efectuarea scarii etalon (25; 12,5; 6,25; 3,12; mg/ml).

Tabelul nr.4 - Echivalenta concentrarii/ diametre pentru solutia standard de IgG bovin determinata prin metoda Mancini

2.2. Rezultate

Din tabelul de mai jos reiese ca s-au folosit concentratii diferite de IgG de la 1,55 la 50 mg %. Corespunzator acestor concentratii zona de difuzie a proteinelor diferi in functie de concentratia folosita; astfel in cazul unei concentratii mici mg % Ig zona de difuzie este de 10 mm. Comparativ cu concentratia de 50 mg Ig % unde se constata marirea zonei de difuzie radiala, aceasta fiind de 15mm.

Imaginile fotografice (foto 1) sunt sugestive pentru descresterea diametrului ariei de precipitare direct proportional cu concentratia.

Graficul etalon constituit prin aplicarea valorilor perechi ale concentratiei respectiv diametrelor zonelor de complexare IgG bovin - ser anti IgG bovin intr-un sistem de axe de coordonate este prezent in fig. 1.

Se observa ca in acest caz graficul de regresie este o dreapta definita de functia:

y = f(x) sau, aplicata datelor problemei

Ap = f(c) unde Ap este aria zonei de precipitare iar c este concentratia probei in imunoglobulina.

2.3. Discutii

Cu toate ca tehnica difuziei simple in gel de agar pentru determinarea concentratiei unei proteine / imunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgE) nu este de ultima ori» utilitatea ei ramane de necontestat. Interpretarea rezultatelor se poate face si subiectiv, apreciind doar prezenta compusului de cercetat prin sesizarea prezentei sau a absentei ariilor de precipitare / complexare, dar poate fi si una directiva, diametrele zonelor respective fiind masurabile. Datele obtinute prin masuratori pot fi interpolate pe graficul trasat, asa cum s-a aratat, prin inscrierea valorilor standard intr-un sistem de coordonate rectangular.

Utilizarea acestui grafic se dovedeste si in cazul determinarilor ulterioare, cand, fara a cunoaste concentratia intr-un compus analizat a unei probe, aceasta poate fi citita prin interpolarea diametrelor masurate de pe preparatul de gel.

Cateva aplicatii ale metodei si exemple de utilizare ale scarii etalon vor fi trecute in revista in cele ce urmeaza.

CAPITOLUL III

EVALUAREA CONCENTRATIEI IgG LA BOVINE CU LEB SI HIPERSENSIBILIZARKTUBERCULINICA FRIN METODA MANCIN1

Atat leucoza enzootica bovina cat si tuberculoza sunt infectii cronice in care_, prezenta agentului etiologic (virus sau bacterie) in organism, in timp indelungat, induce Modificari la nivelul structurii si functionarii sistemului imun.

Imunoglobulina G reprezinta efectorul umoral esential / majoritar implicat in protectia antiinfectioasa. Stabilirea concentratiei circulante a acestei imunoglobuline poate oferi masura competentei antiinfectioase umorale a organismului luat in studiu Cu toate ca in ambele afectiuni mentionate, raspunsul celular are o pondere insemnata, nici semnificatia fluctuatiilor concentratiei IgG nu este de neglijat.

Scopul acestui capitol a fost acela ca, utilizand metoda Mancini, sa fie trecute in revista modificarile aparute la nivelul IgG circulant la vaci cu leucoza, vaci tuberculino - reagente comparativ cu animalele sanatoase.

3.1. Materiale si metode

Pentru efectuarea determinarilor au fost necesare urmatoarele:

agar medinal cu pH de 8,6

tampon medinal pH de 8,6

pipete Pasteur si gradate

eprubete

ser anti IgG bovin preparat de INMV Pasteur liofilizat: se dilueaza pentru lucru extemporaneu cu 2 ml apa distilata

lame de sticla (lame obisnuite de microscop)

perforator de godeuri de 3 mm

camera umeda

IgG bovin, solutie etalon

Modul de lucru

Solutia tampon si agarul sunt preparate conform protocolului de lucru descris la capitolul II. Agarul scos de la frigider se pune la topit pe o baie de apa calda. intr-un stativ se pun 12 eprubete in care se repartizeaza in fiecare urmatoarele solutii:

- 1,5 ml solutie tampon cu pH de

ml ser anti IgG de bou

Se degreseaza lamele de sticla si se etaleaza pe o suprafata plana. Cu ajutorul unei pipete gradate se iau 2 ml din agarul adus la temperatura de 64° C si se introduce in eprubeta peste solutia tampon si serul anti IgG de bou. Amestecul se toarna pe lama cu grija pentru a evita scurgerea. Daca marginile lamei sunt slefuite amestecul gel + ser anti IgG + tampon se scurge de pe lama, se modifica pe suprafata subiacenta si nu se mai poate folosi, datorita faptului ca retopirea duce la alterarea calitatilor de reactie ale serului anti IgG.

Operatia se repeta pana la turnarea tuturor celor 12 lame.

Observatie: Manopera trebuie executata foarte repede si exista riscul de a se produce lipsa de uniformitate a suprafetei agarului, ceea ce deterioreaza calitatea substratului pentru testare.

Dupa turnarea agarului, lamele se pun in camera umeda pana la decuparea godeurilor, altfel se usuca. Decuparea godeurilor se face cu perforatorul de godeuri, lama fiind asezata pe un sablon decupat anterior. Urmatorul pas, este introducerea serului (probelor de testat) in godeuri, pentru aceasta folosindu-se tuburi capilare, pipete Pasteur sau pipete automate, umplerea se realizeaza pana la nivelul agarului cu grija ca serul sa nu difuzeze peste agar. in paralel, pentru fiecare serie se lucreaza o proba de IgG bovin standard.

Lamele astfel pregatite se introduc in camera umeda, timp de 24-48 ore, la temperatura de 20° C.

Dupa expirarea timpului de incubare lamele se citesc cu ajutorul unei rigle masurand zona de difuzie radiala a IgG din serul de testat.

Rezultatele se compara cu scara etalon, fiind interpolate pe grafic astfel: valoarea citita este incadrata pe axa diametrelor; se duce apoi o paralela la axa concentratiilor prin acest punct, pana cand intalneste graficul. Se coboara apoi o perpendiculara din punctul de intersectie pe axa concentratiilor. Noul punct de intersectie obtinut indica valoarea concentratiei IgG din proba.

3.2. Rezultate

Valorile diametrelor si cele ale concentratiilor corespondente sunt prezentate in tabelele 5 si 6:

In cazul lotului de probe provenit de la animalele din ferma Bologa, indemne atat pentru leucoza enzootica bovina cat si pentru tuberculoza s-a constatat in urma masurarii diametrelor de difuzie o omogenitate in privinta rezultatelor cu mici exceptii la proba numarul 2 si 3 la care apare o zona de difuzie a IgG din ser mai mare 14,5 mm respectiv 15 mm, la o singura proba (23) apare o zona de difuzie mai mica 13 mm, la restul probelor aceasta este de 14 mm.

In urma calculelor efectuate s-a stabilit ca media acestor probe este de 14,05 mm cu o varianta de 0,247222 si o deviatie standard de 0,497214.

La probele provenite din ferma de vaci din Lunca Mures efectiv cu tuberculoza declarat in urma citirii rezultatelor testului Manei ni s-au obtinut urmatoarele rezultate prin masurarea diametrelor de difuzie: valoarea minima a fost de 13 mm, intalnita la probele 1 si 6 provenite de la bovine incadrate in categoria recontrol, iar valoarea maxima a fost de 16 mm intalnita la o singura proba (7), animalul respectiv fiind incadrat in categoria animalelor pozitive la tuberculoza.

S-a mai testat proba provenita de la un animal pozitiv la tuberculoza: proba 4, dar reactia acesteia a fost slaba doar de numai 13,5 mm.

In urma efectuarii calculului s-a ajuns la o medie de 14,5 mm iar corespunzator acesteia varianta este de 11,389 si deviatia standard de 1,055409.

Tabel nr. 5 - Valori ale diametrelor zonelor de precipitare cu gel obtinute

prin prelucrarea serurilor provenite de Im bovine cu TBC si LEB

comparativ cu lotul sanatos

In cazul efectivului din Biharia declarat ca pozitiv pentru LEB, in urma citirii zonelor de difuzie a IgG in agar s-au obtinut urmatoarele rezultate: valoarea minimi a fost de 12,5 mm intalnite la proba 5, iar valoarea maxima de 15,5 intalnita la proba 11.

Media acestor probe a fost de 14 mm iar varianta de 0,0144444 si cu o deviatie standard de 0,971825.

Concentratiile de IgG determinate prin interpolarea diametrelor pe curba etalon sunt prezentate in cele ce urmeaza.

In cazul lotului de animale sanatoase se constata ca valoarea minima a concentratiei de IgG bovin s-a determinat la proba cu numarul 23, aceasta fiind de 12,5 mg, iar valoarea maxima de 50 mg s-a intalnit la proba numarul 3. La celelalte probe s-au obtinut rezultate identice valorile fiind de 25 mg. Prelucrand statistic valorile experimentale s-a obtinut o medie a concentratiilor in cazul acestui lot de bovine de 28,58 mg cu o varianta de 132,880 si o deviatie standard de 11,522.

In cazul probelor provenite din efectivul de animale tuberculino-reagente in urma prelucrarii prin testul Mancini rezultatele obtinute au fost urmatoarele: se constata ca valorile minime ale concentratiilor de IgG din serul testat la probele 1,6,12 au fost (12,5 mg), iar valoarea maxima de 53,3 mg a fost intalnita la proba 7, provenita de la un animal pozitiv pentru tuberculoza. Restul valorilor sunt intermediare, bovinele respective fiind incadrate in categoria recontrol. Media acestor valori a fost de 33,58 cu o varianta de 312,052 si o deviatie standard de 17,66502.

Prin analiza probelor provenite de la efectivul de bovine seropozitiv pentru leucoza de la ferma din Biharia, s-au pus in evidenta urmatoarele rezultate: valorile minime ale concentratiilor de IgG au fost de 12,5 mg si s-a pus in evidenta in cazul probelor 7 si 9, la polul opus situandu-se valoarea maxima care a fost de 51,6 mg, corespondenta probei 11 la care diametrul zonei de difuzie a fost cea mai mare. Valorile calculate dupa aceste rezultate au fost:

- media de 31,82 mg

- varianta de 231,1662

deviatia standard de 15.20415

Tabelul nr. 6 - Valori ale concentratiei de IgG obtinute prin testarea serurilor provenite de la bovine cu TBC si LEB comparativ cu lotul sanatos

(mg %)

3.3. Discutii

IgG reprezinta principala imunoglobulina circulanta antiinfectioasa, atat ca pondere cat si ca activitate directa,

Concentratia acestei imunoglobuline este redusa in cazul raspunsului imun primar, unde predomina IgM dar creste substantial in cazul raspunsului imun secundar (de recontact) sau in cazul stimularii antigenice permanente.

Din aceste motive, cuantificarea concentratiei imunoglobulinei G serice reprezinta unul dintre dezideratele importante ale conturarii profilului imunologic in oricare afectiune determinata de microorganisme.

Metoda Mancini sau difuzia simpla in gel de agar permite realizarea acestei evaluari prin utilizarea unui ser anti IgG de specie si a unei imunoglobuline purificate de la specia in studiu, folosita ca etalon.

Analizand rezultatele obtinute se poate observa ca la bovinele sanatoase concentratia imunoglobulinelor G circulante este mai redusa decat la celelalte doua categorii testate. Cu toate ca diferentele nu sunt semnificative statistic si ar fi fost de asteptat ca in cazul bovinelor cu LEB, valorile sa fie mai mari, datele experimentale definesc o reactivitate umorala ceva mai pronuntata la bovinele tuberculino reagente.

CAPITOLUL IV

INFLUENTA EXTRACTELOR DE CALENDULA SI ECHINACEEA ASUPRA CONCENTRATIEI IgG CIRCULANTE

Prin aceasta metoda s-a incercat sa se puna in evidenta influenta extractelor de Calendula si Echinaceea asupra IgG circulante comparativ cu serul fiziologic si alcoolul de 70°. Se cunoaste influenta benefica a administrarii unor extracte vegetale in vivo, pentru tratamentul sau preventia a diferite afectiuni, exista insa foarte putine studii referitoare la modul de actiune al acestor principii activi in vitro. O astfel de demonstratie poate contribui la elucidarea catorva aspecte de mecanisme fundamentale.

4.1. Materiale si metoda

Pentru aceasta metoda sunt necesare urmatoarele materiale:

agar (pregatit conform metodei descrise la capitolul II)

ser anti IgG de bou Pasteur

solutia tampon

perforator de godeuri

pipete de sticla sterile

pipete automate

camera umeda

alcool de 70°

ser fiziologic

extract de Calendula

extract de Echinaceea

Tehnica de lucru

Agarul si solutia tampon se prepara anterior. Cursul acestei metode este identic cu cel descris in capitolul II pana la stadiul in care este turnat agarul pe lama si sunt decupate godeurile.

Probele care urmau a fi investigate au provenit de la animale tuberculino - reagente (n=3) si respectiv pozitive pentru leucoza enzootica (n=3).

Pentru a urmari efectul in vitro al extractelor vegetale asupra capacitatii de complexare a IgG bovin din probele de cercetat cu serul anti IgG, probele au fost puse in contact cu extractele alcoolice de Calendula Cofficuialis si E. Augustifelia, in urmatoarele variante: intr-o placa cu 96 de godeuri peste cate 50 yl de ser de cercetat s-au adaugat ser fiziologic, respectiv extracte, ana partes.

Drept martor a fost utilizata dilutia serului cu alcool de 70° , care a servit ca si solvent pentru extracte.

Variantele au fost notate SF, Ale 70° , Cal si Ech. Probele astfel diluate au fost repartizate in godeurile practicate in gelul de agar. Varianta cu SF a fost realizata in scopul estimarii activitatii IgG in titru de 1:2.

Lamele au fost incubate in continuare ca si in situatiile precedente. Interpretarea rezultatelor s-a realizat in acelasi mod.

Operatia este similara si pentru probele de tuberculoza pe aceeasi placa, cu leucoza. Dupa pregatire, aceste solutii se vor introduce cu tuburi capilare in godeurile din agar decupate anterior. O ultima verificare a godeurilor inainte de a introduce probele in vederea eliminarii cantitatii de apa care s-a acumulat din cauza tinerii lamei cu agar in camera umeda pana la prepararea probelor.

Dupa ce probele de testat atat de leucoza cat si de tuberculoza au fost repartizate in godeuri, lamele se pun in camera umeda urmand sa fie citite la 24ore.

4.2. Rezultate

Citirea la 24 de ore a pus in evidenti valorile prezentate in tabelul numarul 7.

Tabelul nr. 7 - Valori ale diametrelor zonelor de precipitare in gel obtinute prin prelucrarea statistica cu extractele vegetale pentru loturile experimentale

In cazul lotului LEB pozitive se constata ca diametrul zonelor de precipitare difera in functie de solutia folosita. Aceasta valoare este minima 13 mm in cazul in care proba de cercetat s-a diluat cu serul fiziologic si maxima 17 mm in cazul diluarii probei cu alcool de 70° si in cazul diluarii cu extract de Echinaceea, pentru 2 probe.

Calculand media acestor rezultate s-au obtinut valori de 16,666 cu o varianta de 0,333 si o deviatie standard de 0,577 in cazul probelor tratate cu extract de Echinaceea si o medie de 13,66 cu o varianta de 0,333 si o deviatie standard de 0,577. Se poate spune ca in acest caz extractul de Calendula actioneaza inhibitor iar alcoolul de 70° si extractul de Echinaceea stimulator asupra sistemului imun.

In cazul probelor provenite de la taurine tuberculino-reagente diametrul zonelor de precipitare este minim 15 mm in cazul tuturor probelor testate cu ser fiziologic la proba 3 testata cu alcool, la proba 1 cu extract de Calendula, la proba 2 cu extract de Echinaceeea, si maxima de 17 mm la tratamentul cu alcool de 7IT.

Spre deosebire de probele de la animale LEB pozitive la cele tuberculino-reagente, valoarea raspunsului imun este mai buna la extractul de Calendula decat la cel de Echinaceea.

Citirea de 48 de ore a pus in evidenta urmatoarele valori (exprimate in mm):

In cazul citirii la 48 de ore se constata ca pentru probele provenite de la bovine LEB pozitive, valoarea minima a zonei de difuzie s-a inregistrat in cazul probelor tratate cu ser fiziologic, aceasta fiind de 17 mm. Media probelor de ser fiziologic a fost de 17,66 cu o varianta de 0,33 si o deviatie standard de 0,577.

Alcoolul a determinat in acest caz un raspuns la toate probele, diametrele fiind de 19 mm. Raspunsul este bun si in cazul extractului de Calendula, media fiind de 19 cu o varianta si o deviatia standard de 1.

Valoarea cea mai mare a diametrelor zonelor de difuzie s-a inregistrat in cazul extractului de Echinaceea, valoarea maxima din toate cele 3 probe testate fiind de 21 mm in cazul probei 1. La aceasta testare valoarea medie este de 20 iar varianta si deviatia standard de 1.

In cazul probelor de la bovine tuberculino - reagente am obtinut urmatoarele valori:- valoarea minima a ariei de difuzie s-a inregistrat in cazul probelor tratate cu alcool de 70° , egala cu 18 mm la toate probele.

Tabelul nr. 8 - Valori ale diametrelor zonelor de precipitare citite in cazul probelor de ser tratate cu extracte vegetale la loturile experimentale la 48

de ore de la incubatie.

In cazul probelor tratate cu ser fiziologic raspunsul este unanim de 19 mm la toate probele.

Valoarea maxima a zonei de precipitare (22 mm) s-a inregistrat la ambele extracte, totusi in cazul extractului de Echinaceea, valorile insumate a celorlalte probe dau o medie mai mare decat in cazul extractului de Calendula. Media este de 20,66 cu o varianta de 1,33 si o deviatie standard de 1,157.

Pentru probele tratate cu extract de Calendula, valoarea medie a fost de 19,66 cu o varianta de 4,33 si o deviatie standard de 2,080.

Tabelul nr. 9 - Valori ale concentratiilor de IgG exprimate in mg % in urma prelucrarii serurilor cu extracte de Calendula si Echinaceea (dupa 24 de ore de incubare)

In urma testarii probelor provenite de la bovine cu LEB, rezultatele obtinute prin interpolare dupa 24 de ore incubare au fost urmatoarele:

- probele tratate cu ser fiziologic provenite de la bovinele sanatoase au precipitat destul de slab, valorile obtinute fiind cuprinse intre minima de 12,5 mg la proba 1 si maxima de 25 mg (2 si 3) cu o medie de 20,83, cu varianta de 52,683 si o deviatie standard de 7,21.

In cazul probelor tratate cu alcool raspunsul a fost omogen, inregistrandu-se valori foarte apropiate intre 50 mg la proba 2 si 56,6 la proba 1, media fiind de 53,3 mg, cu o varianta de 10,83 si o deviatie standard de 3,3.

In cazul tratamentului cu extract de Calendula concentratiile in IgG au fost urmatoarele: - valoarea minima 25 mg la proba 3 si maxima 53,5 mg la proba 2, cu o medic de 42,7, varianta de 239,4 si o deviatie standard de 15,4.

Probele de ser tratate cu extract de Echinaceea au avut concentratiile cele mai mari de IgG - 56,6 mg. Calculele ulterioare au pus in evidenta faptul ca media valorilor este de 55,5 mg cu o varianta de 3,6 si o deviatie standard de

In urma testarii probelor provenite din lotul de bovine suspecte de
tuberculoza s-au obtinut valorile urmatoare: - in cazul probelor testate cu ser
fiziologic valoarea a fost identica (50 mg) pentru toate probele cu o medie
de 50 mg.

Raspunsul in cazul serului tratat cu alcool de 70° a fost minim (50 mg) la proba 3 si maxim (56,6 mg) la proba 1, cu o medie de 54,4, varianta de 14,52 si o deviatie standard de 1,90.

In cazul folosirii pentru testare a extractului de Echinaceea valorile concentratiei de IgG au fost dupa cum urmeaza: valoarea minima 25 mg la proba 3 si cea maxima de 53,3 la proba 1 cu o medie de 42,7 mg, varianta de 239,4 si o deviatie standard de 15,47.

Tabelul nr. 10 - Valori ale concentratiei de IgG exprimata in mg % obtinute in urma prelucrarii serurilor cu extracte de Echinaceea si Calendula (Citirea la 48 de ore)

Citirea la 48 de ore a concentratiei de IgG obtinute prin analiza serurilor provenite de la bovinele suspecte de LEB au fost dupa cum urmeaza:

in cazul probelor tratate cu ser fiziologic valoarea medie obtinuta a fost 58,86 mg cu o variatie de 3.85 si o deviatie standard de 1,96.

in cazul probelor tratate cu alcool de 70° raspunsul este acelasi la toate cele 3 probe, adica 63,3 mg.

probele de ser tratate cu extractul de Calendula au dat valori ale concentratiei de IgG de minim 60 mg la proba 3 si maxim 66,6 la proba 1 - cu o medie de 63,3 mg, varianta de 10,9 si o deviatie standard de 3,3.

rezultatele obtinute cu extractul de Echinaceea au avut o medie de 66,63 mg cu o variatie de 11,22 si o deviatie standard de 3,35.

Valorile citite la 48 de ore de la probele de ser provenite de la bovine suspecte de tuberculoza au fost urmatoarele:

la probele tratate cu ser fiziologic media rezultatelor a fost de 63,3 mg;

la cele tratate cu alcool media a fost de 60 mg;

extractul de Calendula folosit a dat valori ale concentratiei de IgG cuprinse intre 60 mg la proba 2 si 73,3 mg la proba 3 cu o valoare medie de 65,5 mg.

extractul de Echinaceea testat a dat valorile cele mai mari ale concentratiei de IgG cu cifre cuprinse intre 66,6 mg si 73,3 mg, cu o valoare medie de 68,8 mg.

4.3. Discutii

Componentele active prezente in extractele vegetale actioneaza sinergie sau antagonic, rezultand efecte de nutritie sau stimulare.

Tehnica Mancini, prin simplitate si reproductibilitate permite testarea in vitro a efectelor unor extracte vegetale. Este vorba aici nu de influenta combinatiei de compusi asupra sintezei imunoglobulinelor ci de modul in care acestea pot impiedica sau regla mersul reactiei de complexare a imunoglobulinei cu serul anti IgG.

Analizand rezultatele obtinute la animalele LEB pozitive se constata ca, dupa 24 de ore de incubare, activitatea de complexare scade foarte putin prin diluare cu SF, cu toate ca titrul se reduce la jumatate.

Alcoolul are cu siguranta un rol stimulator ducand la extinderea zonelor de precipitare obtinute comparativ cu probele netratate sau cu probele tratate cu ser fiziologic. Comparand valorile obtinute pentru cele doua extracte cu cele induse de tratamentul cu alcool, cu toate ca diferentele nu sunt semnificative, doar extractul de Echinaceea se dovedeste stimulator in timp ce extractul de Calendula este inhibitor, in variante de dilutie utilizata.

Trebuie sa excludem aici capacitatea precipitanta a alcoolului deoarece exista diferenta in plus sau in minus in privinta zonelor de precipitare, cu toate ca in variantele experimentate concentratia alcoolului nu variaza.

In cazul probelor de la bovinele tuberculino - reagente, comparativ cu martorul netratat, valorile induse de alcool si de extractul de Calendula sunt mai mari. Cu toate acestea, doar alcoolul actioneaza stimulator pentru ca, prin comparatia diametrului obtinut in acest caz cu cele din cazul probelor tratate cu extracte, cele din urma induc diametre mai mici. Valorile sunt situate in apropierea celei a probei netratate.

In aceasta etapa este posibila diferentierea actiunii unor extracte vegetale asupra capacitatii de complexare a IgG bovin la bovine aflate in situatii epidemiologice diferite (infectia cu virusul LEB respectiv, pozitivitatea cutanata pentru TBC).

Se observa astfel ca, desi este vorba de aceeasi specie si de acelasi tip de imunoglobulina, extractul de Echinaceea augustifalia este stimulator la bovine seropozitive pentru LEB si inhibitor la bovine tuberculino - reagente. Extractul de Calendula se dovedeste inhibitor la vacile seropozitive pentru LEB si mai putin inhibitor decat cel de Echinaceea in cazul lotului tuberculinat.

Eficacitatea pe termen lung (citirea la 48 de ore) este demonstrata prin cresterea diametrelor zonelor de precipitare peste cele ale probelor tratate cu ser fiziologic sau alcool. In cazul bovinelor LEB pozitive efectul extractului de Calendula este indiferent comparativ cu martorul alcool, in timp ce Calendula isi mentine efectul stimulator.

Pentru grupul de bovine tuberculino - reagente efectele sunt mai pronuntate decat la lotul precedent in cazul ambelor extracte. Atat extractul de Echinaceea cat si cel de Calendula exercita aici un efect stimulator mai pronuntat in aceasta ordine.

Rezultatele obtinute demonstreaza bioactivitatea in vitro a extractelor testate. Este nevoie de precizarea unei scheme de dilutie cu efectele cele mai pronuntate.

CONCLUZII

Extractul de Calendula officinalis exercita un efect inhibitor asupra capacitatii de complexare a IgG bovin cu serul anti IgG (valoarea concentratiei - 42,76 mg) comparativ cu cel de Echinaceea augustifalia care actioneaza stimulator (valori de 55,5 mg ) dupa 24 de ore.

In cazul lotului de bovine tuberculino - reagente, extractele utilizate actioneaza inhibitor, cel de Calendula mai putin (52,2 mg) decat cel de Echinaceea (42,76 mg ) dupa 24 de ore de incubare.

Tratamentul serurilor cu alcool actioneaza stimulator in toate cazurile testate, determinand cele mai mari diametre ale zonelor de precipitare decat cele induse de serurile integrale ale fiecarei categorii (valori: alcool LEB - 53,3 mg; alcool TBC - 54,4 mg; seruri integrale LEB, TBC).

Efectele extractelor vegetale se manifesta mai pronuntat in termen lung (citirea de la 48 de ore). Ambele extracte se dovedesc in acest caz stimulatoare (Echinaceea - 66,63 mg mai mult decat Calendula - 63,3 mg).

Metoda Mancini este o metoda simpla si reproductiva care permite
testarea in vitro a efectelor unor extracte vegetale si sesizarea
diferentelor dintre probele provenite de la animale cu diferite infectii.

BIBLIOGRAFIE

ANDRIES LUCIA, GLINESCU A. - (1992) - Compediu de imunologie fundamentala, Ed. Stiinta, Chisinau.

BAIES L, BRAN L. - (1972) - Bolile infectioase ale animalelor domestice, Ed. Didactici si Pedagogica, Bucuresti.

BARNAI L, PARVU GH., IUGA C. - Leucozele si bolile de imunosupresie SIDA/AIDS - Like la animale, Ed. Ceres, Bucuresti, 1995.

BERCEANU ST., PAUNESCU E. - (1981) - Biologia si Patologia imunitatii, Ed. Academiei RSR, Bucuresti.

BICA POPII VALERIA, RADUCANESCU H. - (1966) - Microbiologic si imunologie veterinara (lucrari practice), Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti.

BILBIIE V., POZSGI N. - (1984) - Bacteriologie medicala, voi. I, Bucuresti.

CONSTANTINESCU GH. - (1984) - Atlas imunoelectroforetic, Ed. Medicala, Bucuresti.

GOUREAU JM., PARODI AL. - La leucose cutanee bovine. Le point veterinaire, voi. 18, Nr. 95, p.86.

GHERGARIU S. - (1984) - Bolile alergice si autoimunopatiile la animale, Ed. Ceres, Bucuresti.

10.GHETIE V., MICUSAN V. - (1966) - Analiza imunochimica, Ed. Academiei RSR, Bucuresti.

11.IONICA C. si col. - (1974) - Tuberculoza animalelor domestice, Ed. Ceres, Bucuresti.

12.KENYON SJ., GUPTA P., FERRER JF. - Presence of bovine leukemia virus (BLV) in milk of naturaly infected cows, 4 , Ist Symp, on bovine leukosis, CECA, CEE, CEEA, Bruxelles Louxembourg 1980.

13.MARICA D., RAPUNTEAN GH. - (1983) - Lucrari practice de

Microbiologic si Virusologie, Tipo Agronomia, Cluj-Napoca.

14.M0RARU I. - (1984) - Imunologie, Ed. Medicala, Bucuresti.

15.MORARU I., PAUNESCU E. - (1981) - Dictionar Enciclopedic de Imunologie, Ed. Stiintifica si Enciclopedica, Bucuresti.

16.NICOLAESCU T. - (1984) - Imunopatologia tubului digestiv, Ed.

Academiei RSR, Bucuresti.

17.PASTORET P., GOVAETS A., BAZIN H. - (1990) - Imunologie animale,

Flamarian, Paris.

18.POLI G. - (1988) - Microbiolgia & imunologia U.T.E.T., Milano.

19.POP M., ONET E., VASIU C, RAPUNTEAN GH. - Lucrari practice si

clinice de boli infectioase ale animalelor domestice: Uz intern Inst. Agro.

Cluj-Napoca.

20.POP M., VASIU C, RAPUNTEAN GH. - (1981) - Ghid de diagnostic in

bolile infectioase ale animalelor, Ed. Ceres, Bucuresti.

21.RAPUNTEAN GH., MARINA SPANU, OVIDIU SPANU - (1994) -

Lucrari practice de imunologie - Tipo Agronomia, Cluj-Napoca.

22.RESSANG A., MASTENBROEK A., QUAK J. - Studies on bovine,

leukosis IX, Excretion of bovine leukosis virus Zentbl, Vet. Med., B. 29,

137, 1982.

23.RADUCANESCU H. - (1973) - Bacteriologic veterinara aplicata, Ed.

Ceres, Bucuresti.

24.ROITT I. - (SEVENTH EDITION) - Essential Immunology, Blackwell

Scientific Publications, Oxford, 1989.

25.VIOR C, RADUCANESCU H., MANOLESCU N., POPO VICIU A. -

(1980) - Imunitatea si imunoprofilaxia la animale, Ed. Ceres, Bucuresti.

26.VLADUTIU C. si colab. - (1970) - Bolile bovinelor, Ed. Ceres,

Bucuresti.

27.VOLINTIR V. - Bolile infectioase ale animalelor domestice, Ed.

Didactica si Pedagogica, Bucuresti, 1975.

28.ZENEA C. - (1980) - Imunologie clinica, Ed. Medicala, Bucuresti