Structura ARN

STRUCTURA ARN

1. Structura primara a ARN

Ca si in cazul ADN, structura primara a ARN este determinata de succesiunea nucleotidelor in catena. Desi apropiata de structura ADN, exista doua deosebiri:

prezenta gruparii hidroxil in pozitia 2' a ribozei;

prezenta, ca baza pirimidinica, a uracilului in locul timinei.

Prezenta gruparii hidroxil impiedica - partial - asocierea ARN sub forma bicatenara, marind flexibilitatea catenei, astfel ca, diversitatea conformationala a ARN, ca si reactivitatea acestuia sunt mai accentuate comparativ cu ADN.

Determinarea structurii primare a ARN, realizata pentru prima data prin hidroliza alcalina a condus la un rezultat oarecum neasteptat: au fost identificati atat 3'- cat si 2'-ribonucleozidfosfati.

O structura primara similara cu ADN, in care bazele se succed in ordinea 3' - 5' a fost ulterior confirmata prin utilizarea unor hidrolaze: fosfodiestera din splina porcina care scindeaza legatura la pozitia 5', generand 3'-monofosfati si fosfodiestera din venin de sarpe care conduce la 5'-monofosfati; rezulta deci, ca ARN este un fosfodiester 3'-5'.

Prezenta, intre produsii de hidroliza neenzimatica, a 2'-monofosfatilor sugera insa si existenta unor legaturi 2'-5'. Prezenta unor secvente de acest tip a fost detectata in celulele vertebratelor ca urmare a infectiilor virale. Ca raspuns la infectie, celulele sintetizeaza o glicoproteina - interferonul, care la randul sau determina sinteza unei oligonucleotid-sintetaza care catalizeaza sinteza unor oligonucleotide ce contin 3-8 resturi, de obicei de riboadenina, legate 2'-5'. In sfarsit, se pare ca acest oligonucleotid induce sinteza unei ribonucleaze, RNazaN care scindeaza ARN mesager viral. Prezenta legaturilor 2'-5' este mentionata si in procesul de autoscindare (self splicing) al ARN.

Interesant este faptul ca, din punct de vedere termodinamic, legaturile 3'-5' sunt mai putin stabile decat cele 2'-5', dar totusi, ele sunt predominante, ceea ce sugereaza existenta unei selectii realizata in timpul evolutiei.

2. Structura secundara a ARN

Desi prezenta gruparilor hidroxil 2' limiteaza posibilitatile de asociere intercatenare, totusi ARN poate exista atat in forme asociative ce contin secvente dublu catenare relativ lungi, cat si in forme globulare care contin secventa de tip duplex scurte, legate prin segmente monocatenare.

Se pare ca aceeasi grupare 2' impiedica formarea unor conformatii de tip B; sunt posibile insa conformatii de tip A. In fibrele de ARN au fost identificate 2 variante de structura A: A si A'. Structura A este caracteristica unor secvente de tip poli ((rA) poli(rU) care, la tarii ionice scazute, contin 11 perechi de resturi de spira (de dreapta). Zaharidul are o pliere de tip C3'-endo, restul caracteristicilor fiind asemanatoare cu cele ale A-ADN. Daca concentratia de sare este mai mare de 20%, conformatia A se transforma in A' care contine 12 perechi de resturi pe spira. In ambele cazuri, bazele sunt relativ distantate fata de axul elicei (aprox 4,4Å) astfel ca rezulta un sant major foarte adanc, santul minor fiind aproape inexistent. Secvente de tipul mentionat au fost identificate in toate variantele de ARN: ARN mesager (ARNm), de transport (ARNt) sau ribosomal (ARNr), existenta regiunilor de tip duplex fiind permisa de secvente complementare din mono-catena ARN. De exemplu, in ARNt nucleotidele situate in apropierea capatului 5' formeaza o elice cu nucleotidele situate tocmai in celalalt capat, 3'.

Aceste secvente dublu-catenare contin nu numai perechi normale A:U si G:C, dar si numeroase perechi G:U, mai putin stabile energetic.

Moleculele ARN mai lungi, ca de exemplu fragmentul 16S al ARNr contine probabil mai multe secvente dublu catenare, separate prin bucle (lupinguri) monocatenare.

Mentinerea structurii depinde de mai multi factori: concentratia de sare, pH, temperatura, ioni (Mg²⁺, ioni poliaminici). La temperaturi suficient de ridicate ARN este "total" denaturat, disparand secventele dublu-catenare.

2.1. Secventele de tip "cocoasa", ac de par si buclat

Lungimea mai redusa a ARN a permis realizarea unor studii teoretice privind constantele de asociere a oricaror perechi de baze situate in diverse vecinatati, inclusiv in cazul existentei unor structuri deosebite de tip "cocoasa", "ac de par" sau "buclat". Astfel, formarea unei structuri ac de par ce contine 5-6 baze, nelegate, necesita 25 kJ/mol, o cocoasa aprox. 9 kJ/mol, iar o bucla ~13 kJ/mol. Folosindu-se aceste date, ca si alte determinari, a putut fi determinata structura unor ARN, de ex. a unui fragment de 55 nucleotide din ARN al virusului R17.

2.2. Structura ARN de transfer (transport)

Datorita catenei mai scurte, ARNt reprezinta una dintre cele mai studiate molecule de acid nucleic, atat in stare nativa (a fost determinata secventa primara a cateva sute de ARNt), cat si a unor forme obtinute prin sinteza.

Toate moleculele studiate contin contin o secventa identica -CCA la capatul 3', denumit "capat acceptor". In timpul sintezei proteice, riboza din restul terminal A3' se leaga de o molecula de aminoacid, prin formarea unei legaturi esterice. exista si alte secvente inalt conservate in structura tARN, in special cele care determina structura tertiara a moleculei (conformatia spatiala).

Desi numarul de resturi poate varia intre 74 - 95 nucleotide, totusi ele adopta o conformatie secundara similara in forma de trifoi in care patru sau cinci regiuni dublu catenare (stem= tulpina, tija) sunt separate prin bucle monocatenare.

Toate moleculele ARNt au acelasi numar de baze in tija acceptoare (7pb) si in bucla anticodonului si, respectiv,TΨC ambele au cate 7 baze in bucla si 5 pb in tija.

Lungimea variabila a diferitelor molecule de ARN este determinata de existenta unor regiuni variabile: bucla D si bucla "variabila".

A fost determinata si structura tertiara a unor ARNt; ca urmare a "impachetarii", apar legaturi de hidrogen intre baze situate la distante relativ mari in structura secundara. Rezulta o conformatie in forma de L, fiecare latura fiind reprezentata de secvente dublu catenare; conectarea este realizata prin buclele D si TΨC. Bucla anticodonului se gaseste la capatul bratului lung, iar zona acceptoare la capatul bratului scurt. Prin difractie de raze X s-a constatat ca aceeasi structura L se pastreaza si in cazul asocierii ARNt cu proteine.

Sunt prezente numeroase imperecheri neuzuale (Hoogston si altele), legaturi 2'-5', toate determinand structura tertiara a ARNt care este compacta, dar flexibila, astfel incat pot avea loc modificari conformationale care sunt, probabil, esentiale in interactiile cu moleculele proteice.

2.3. ARN antisens

ARN antisens este o molecula scurta, lipsita de capacitatea de codare, dar care se caracterizeaza printr-un grad inalt de complementaritate cu alta molecula de ARN, cu care poate forma hibrizi. ARN antisens poate astfel functiona ca un modulator (represor) al expresiei ARN "tinta". Astfel de molecule au fost obtinute prin sinteza, dar au fost detectate si in celule de procariote, fiind probabil implicate in replicarea ADN plasmidic, in transcrierea ADN bacterian, ca si in translatia ADN mesager din bacterii si bacterofagi.

3. Duplexuri ADN-ARN

In afara de asocierea cu molecule de acelasi tip (duplexuri ADN-ADN si respectiv ARN-ARN) foarte importante sunt si asocierile ADN-ARN. Acestea se pot forma in mai multe cazuri:

transcrierea ADN in ARN mesager complementar;

sinteza unei catena ADN prin retrotranscriptia din ARN viral;

asocierea cu fragmentele ARN "primer" la sinteza fragmentelor Okazaki - (in replicarea ADN),

fiind posibile si alte cazuri.

Hibrizi similari se pot forma si in vitro prin asocierea a doua catene ce comtin baze complementare, de ex. cele formate de catenele de tip ARN poli (rA) poli (dT) si poli (rI)poli(dC). Primul are o conformatie de tip A-ARN (cu 11 pb/spira), iar cel de-al doilea are o conformatie de tip A'-ARN.

Un decamer autocomplementar r(GCG)d(TATACGC) formeaza un duplex de tip Watson - Crick (corespunzator A-ADN sau A-ARN).

Acesti hibrizi sunt mai stabili la procesele de denaturare comparativ cu duplexul ADN-ADN.

Stabilitatea deosebita a duplexului ADN-ARN a condus la ideea construirii unor oligomeri ADN antisens care sa formeze hibrizi si sa inhibe ARNm.

Desi astfel de secvente ADN (ca de altfel si ARN) antisens au fost sintetizate, au fost intampinate greutati deosebite privind traversarea membranelor celulare sau atacul enzimelor de hidroliza. Pentru marirea rezistentei, restul fosforic din legatura fosfodiesterica a fost inlocuit cu resturi fosfortionate, fosforditionate sau metilfosforice, dar heteroduplexurile rezultate au constante de asociere mult mai reduse comparativ cu duplexurile ARN-ADN. Studiile continua, utilizarea de oligonucleotide ARN sau ADN antisens fiind una dintre marile sperante ale terapiei genice.

4. Triplexuri de acizi nucleici

In afara de duplexurile prezentate anterior, sunt posibile si asocieri realizate intre trei catene de acizi nucleici. Primul triplex de acest tip a fost sintetizat in 1957 cand s-a obtinut un complex 2 poli(rU).poli(rA), ulterior fiind obtinute si alte triplexuri; ca de exemplu: 2 poli(rC).poli(rG), una dintre catenele rC fiind protonata.

S-au obtinut si structuri mai complexe, prin asocierea intre carene ribozice si deoxiribozice, ex. cele formate prin asocierea poli(rU-rC) sau poli(dT-dC) cu duplexul poli (dT-dC).poli(dG-dA); ca si in celelalte cazuri, triplexul este stabil la pH acid in prezenta de MgCl₂. Duplexul are o structura de tip A', cea de-a treia catena fiind situata in santul major relativ adanc al duplexului. De asemenea, se observa ca cea de-a treia catena se leaga in special prin legaturi de tip Hoogsteen.

Pentru asigurarea stabilitatii triplexului este necesara utilizarea unui mediu acid, care prin protonarea noii catene reduce repulsia dintre catena anionica si cea polipirimidinica. In afara de Mg² alti stabilizatori sunt Ca(NH₃)₆ sau spermina.

Se presupune ca triplexuri ADN se formeaza in cazul plasmidelor supraincolacite care contin secvente repetitive tip (GAA)₉(CIT)₉ si (AG)₁₂(TC)₁₂.