LUCRARI PRACTICE MICROBIOLOGIE

LUCRARI PRACTICE MICROBIOLOGIE

A. PARTEA GENERALA

L.P. 1/ 06. 10. 2008

Ø      PRINCIPII GENERALE DE CONDUITA IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE.

Ø      NORME DE PROTECTIE A MUNCII IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE.

Ø      APARATURA/ ECHIPAMENTE, MATERIALE UTILIZATE IN LABORATOR.

OBIECTIVELE – tinta ale Laboratorului de Microbiologie:

- stabilirea prezentei sau absentei unor microorganisme intr-un prelevat, pe un substrat etc,

- studierea in vederea identificarii microorganismului: apartenenta la gen, specie, subspecie, tip etc, pe baza unor proprietati ale acestuia:

Caractere morfotinctoriale,

Caractere de cultura,

Caractere biochimice (pigmentogeneza, sinteza de vitamine, aminoacizi, enzime, capacitatea de a fermenta un anumit substrat etc),

Caractere antigenice,

Caractere de patogenitate,

Sensibilitate fata de bacteriofagi,

Caractere genetice,

- demonstrarea faptului ca bacteria izolata este sau nu implicata in procesul infectios,

- testarea rezistentei la antibiotice si chimioterapice,

- monitorizarea evolutiei sub tratament (eficienta tratamentului antibacterian),

- identificarea contaminarii de laborator,

- depistarea purtatorilor sanatosi de germeni patogeni, in activitatea de preventie, profilaxie.

Existenta grupurilor distincte de agenti infectiosi:

- bacterii,

- virusuri,

- fungi,

- protozoare.

Domenii, ramuri diferite ale activitatii umane unde sunt implicate astfel de microorganisme:

- medicina umana si veterinara,

- epidemiologie,

- igiena,

- farmacie,

- industria alimentara,

- industria farmaceutica etc.

Laboratoare profilate pe:

- Microbiologie clinica,

- Microbiologie epidemiologica,

- sanitara,

- sanitar- veterinara,

farmaceutica,

- alimentara,

- biologie moleculara, genetica etc.

2. ORGANIZAREA SI FUNCTIONAREA LABORATORULUI DE MICROBIOLOGIE:

amplasarea cladirii (curenti, lumina, incidenta UV etc)

- planul laboratorului astfel intocmit, incat sa respecte “circuitele” obligatorii: sens unic, prevenirea contaminarilor incrucisate,

- compartimente distincte, cu destinatie bine stabilita, corespunzatoare fiecarei activitati:

• Incapere pentru recoltare probe,
• Incapere pentru receptionarea, inregistrare,     prelevatelor recoltate in afara laboratorului,
• Incapere pentru prelucrarea, insamantarea prelevatelor,
• Mai multe incaperi unde se efectueaza tehnici specifice diferitelor etape de diagnostic bacteriologic (microscopie, identificare pe baza reactiilor exoenzimatice, reactii imunologice etc).

In functie de gradul de contaminare bacteriana a prodului patologic, pot fi: - - Compartiment de Diagnostic Lichide de punctie si prelevate normal sterile,

Compartiment de Diagnostic Infectii digestive,

- Compartiment Diagnostic Infectii respiratorii non – TBC,

- Compartiment Diagnostic Infectii TBC,

- Compartiment Diverse,

- Compartiment preparare Medii de cultura,

Compartiment Sterilizare (caldura uscata, vapori sub presiune),

- Vestiar,

- Grup sanitar cu dus,

Incaperi destinate depozitarii Reactivilor,

Incaperi destinate stocarii si depozitarii tulpinilor izolate de la bolnavi (BK),

- pereti, podele, plafon, imbinarile la colturi: finisaje, materiale,

- mobilier modular, dulapuri aplicate pe pereti, inaltimea mobilierului de la podea,

LABORATORUL TREBUIE SA FUNCTIONEZE CA UN TOT UNITAR, PENTRU ASIGURAREA OBIECTIVELOR PRINCIPALE:

Izolarea, identificarea si testarea rezistentei la antibiotice, a bacteriilor patogene cu rol etiologic,

Prevenirea contaminarii prelevatelor biologice,

Prevenirea raspandirii germenilor patogeni in mediu,

Prevenirea imbolnavirilor profesionale, a infectiilor de laborator.

3. NORME DE PROTECTIE A MUNCII

IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

In Laboratorul de Microbiologie se lucreaza cu:

produse patologice (sange, LCR, materii fecale, urina, sputa, colectii purulente etc),

- bacterii patogene, conditionat patogene, levuri, fungi filamentosi, izolati in culturi,

- microorganisme multidrog- rezistente, izolate de pacienti,

- tulpini de Control extern de calitate, cu rezistenta la antibiotice superioara celor izolate in laborator,

Reguli impuse in activitatea de laborator, pentru eliminarea riscului de contaminare:

1. Strict interzis accesul persoanelor straine in laborator,
2. Toate prelevatele biologice trebuie considerate a fi cu potential infectios,
3. Obligatorie purtarea echipamentului de protectie (echipamentul de laborator sa fie pastrat separate de cel utilizat in exteriorul laboratorului),
4. Purtarea corecta a manusilor de latex (flacara becului Bunsen),
5. Interzis a se manca, consuma bauturi sau a se fuma in incinta laboratorului (in orice incapere din institutia medicala),
6. Nu se recomanda purtarea unghiilor false, lentilelor de contact de catre personalul care manipuleaza tulpini bacteriene,
7. Interzisa pipetarea cu gura,
8. Nu se depun pe masa de lucru obiecte de uz personal (genti, serviete, caiete, haine etc), se depoziteaza in vestiar,
9. Manipularea produsului patologic se face “la flacara” becului Bunsen: orice manevra implica flambarea gatului recipientelor din sticla, atat la deschidere, cat si la inchidere, a pipetelor etc, si sterilizarea prin incalzire la incandescenta (“la rosu”) a ansei bacteriologice (bucla si firul; portansa se flambeaza pe 1/3 din lungimea sa),
10. Bucla ansei incarcata cu produs patologic sau cultura bacteriana, se introduce la “baza flacarii”pentru a fi arsa, unde temperatura este mai scazuta (la varful flacarii exista riscul improscarii cu bacterii inca nedistruse termic si contaminarea executantului si mediului),
11. In momentul manipularii ansei bacteriologice incarcate cu produs biologic sau cultura bacteriana nu se fac gesture ample, necontrolate, nu se lasa ansa din mana atata timp cat este incarcata cu produs contaminant. Este recomandat ca aceste manevre sa se execute in interiorul hotelor de biosiguranta,
12. Inainte de efectuarea unor tehnici de diagnostic bacteriologic, se pregateste protocolul de lucru, se insusesc etapele, se pregateste tot materialul necesar, se controleaza mental evolutia pasilor, pentru a nu exista niciun pericol de raspandire a germenilor sau a contaminarilor incrucisate,
13. Nu se alearga, nu se fac miscari bruste in laborator, pentru a nu creea curenti de aer ce ar putea antrena bacterii cu transmitere aerogena, cu potential infectios,
14. Pipetele gradate, pipetele Pasteur, lamele, lamelele contaminate, dupa folosirea lor, se imerseaza in solutii dezinfectante proaspete, in cilindrii sau cristalizoare, care sa le acopere in proportie de peste ¾ din lungimea lor sau in intregime,
15. Toate obiectele utilizate in procesul de prelucrare a prelevatelor clinice, in scop diagnostic, contaminate, se introduc in saci autoclavabili, apoi in galeti cu capac (etichetate: “Sticlarie” sau “Plastice”) si transportate in Compartimentul Sterilizare, pentru a fi autoclavate,
16. Obiectele ascutite, taietoare, intepatoare (ace de seringa, lame de bisturiu- unica folosinta) se elimina fara a fi atinse, in recipiente de plastic galbene (etichetate corect, cu sigla de biosiguranta) inchise etans si eliminate la Deseuri infectioase, pentru a fi incinerate,
17. Se respecta codul culorilor in laborator: culoarea galbena inseamna material infectios (saci plietilena de diverse capacitati, cutii carton de transport deseuri infectioase, cutii plastic cu capac pentru obiecte taietoare, intepatoare etc) si culoarea neagra care inseamna deseuri menajere, neinfectioase,
18. In cazul unei contaminari accidentale a unei suprafete de lucru cu produs infectios, se anunta imediat persoana ierarhic superioara, se acopera suprafata cu tifon, panza, peste care se toarna solutie dezinfectanta, proaspata, se mentine cel putin 30 min, dupa care se trece a curatarea suprafetei respective,
19. Se recomanda manipularea cu max de atentie a substantelor chimice caustice, toxice (acizi, baze, aldehide, cetone, alcooli) folosind echipament adecvat: manusi, masti, ochelari de protectie etc.
20. Manevrarea gazelor, a diferitelor aparate elctrice (autoclav, centrifuga, pompa de vid etc), a sticlariei de laborator, pentru evitarea oricarui tip de accident de laborator: explozii, incendii, traumatisme.
21. Spalarea cu apa calda si sapun lichid dezinfectant a mainilor, ori de cate ori se incheie o etapa de lucru; se recomanda solutii protectoare ale pielii dupa spalare si stergere cu prosop de hartie de unica folosinta.

Respectarea cu strictete a Normelor de protectie a muncii in Laboratorul de Microbiologie, evita aparitia riscurilor de contaminare, accidentare a personalului, dar si garanteaza lipsa contaminarii cu germeni externi ai probei biologice ce urmeaza a fi prelucrata, deci un diagnostic bacteriologic corect.

4. ECHIPAMENTE, APARATURA:

- microscoape, lupe,

- hote de siguranta biologica (CLS. I, II, III),

- termostate, incubatoare: 28 ºC, 35 ºC, 37 ºC, 42 ºC, 56ºC,

- centrifugi (1000, 2500, 3000, 5000, 10 000- 20 000 tot/min, cu si fara racire),

- balante,

- aparat pentru demineralizare, distilare apa,

- aparat automat de preparare si distribuire medii de cultura,

- pH- metru, psiho- higrometru,

- frigidere, congelatoare (- 20, - 80ºC),

- sisteme automate de izolare bacteriana: BacT/ALERT, BACTEC, MB/ BACT,

- sisteme automate de identificare bacteriana si antibiograme rapide: mini API, VITEK 2 Compact,

- aparatura pentru sterilizare: etuve/ pupinele, autoclave,

- lampi UV,

- pompa de vid pentru sterilizare prin filtrare etc,

• Pentru materialul contaminat:

- galeti de inox cu capac,

- saci autoclavabili,

- cilindri, cristalizoare cu solutii dezinfectante (preparate zilnic),

• Instrumentar divers: foarfeci, bisturie, pense, seringi, anse bacteriologice,
• Truse de coloranti,
• Diverse dispozitive: becuri Bunsen, trepiede, stative metalice, cosuri sarma, cutii cu capac pentru transportul probelor, casolete cu capac si orificii,
• Termometre camera, frigidere (min si max), tehnice (congelatoare, etuva),
• Inventar sticlarie de laborator: eprubete, tuburi de centrifuga, pipete gradate, pipete Pasteur, baghete de sticla, baloane, pahare, exicatoare, cristalizoare, cilindrii gradati, lame si lamele pentru ex. microscopic, camere de numarat,
• Placi Petri 90mm diametru,
• Recoltoare sterile pentru diverse prelevate patologice: tampoane de exudat, recipiente sterile, de unica utilizare, pentru urina, coprorecoltoare,

5. METODE DE STERILIZARE SI DEZINFECTIE

UTILIZATE IN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

DEFINITII:

1. STERILIZAREA: metode prin care sunt distruse sau indepartate toate microorganismele, forme vegetative si forme sporulate, dintr-un produs, mediu lichid sau solid, de pe suprafete etc.

• Septic: prezenta de microorganisme, prin contaminare sau infectie (reactie inflamatorie/ PMN),
• Aseptic: lipsit de microorganisme (orice forma viabila, capabila de reproducere),

2. ASEPSIA: ansamblul de masuri si metode prin care se evita contaminarea, introducerea din exterior intr-un mediu steril sau cu microbiota specifica, a microorganismelor viabile.
3. DEZINFECTIA: metode chimice prin care sunt distruse toate formele vegetative ale microorganismelor, dar nu si a formelor sporulate.
4. ANTISEPSIA: metode de inlaturare sau distrugere a formelor vegetative microbiene, existente pe tegumente, mucoase, plagi, utilizand substante antiseptice.

1. STERILIZAREA:

a)      Metode de sterilizare prin caldura:

a.1. caldura uscata,

a.2. caldura umeda,

b)      Metode de sterilizare prin filtrare,

c)      Metode de sterilizare fizica, cu ajutorul radiatiilor,

a.1. Sterilizarea prin caldura uscata:

v     Sterilizarea prin incalzire la incandescenta “la rosu”:

- ansa bacteriologica metalica (bucla, fir),

- spatula de insamantare,

v     Flambarea: trecere repetata prin flacara becului Bunsen, cu incalzire la

temperaturi inferioare incandescentei,

- indicata pentru portansa, gatul recipientelor de sticla (eprubete, tuburi, baloane,

capilarul pipetelor Pasteur) etc.

- contraindicate pentru obiecte voluminoase care se incalzesc si se racesc greu

(pipete gradate) sau din materiale pe care caldura le degradeaza (material plastic,

otel etc),

v     Incinerarea: arderea cu reducere la cenusa.

In laboratoarele de microbiologie este indicata pentru materialele de unica

folosinta din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele si carcasele

animalelor de experienta (unde acestea exista).

Incineratoarele care functioneaza in spitale necesita respectarea normelor de protectie impotriva poluarii mediului.

Se prefera incheierea de contracte cu firme specializate care efectueaza incinerarea in afara oraselor.

v     Sterilizarea cu aer cald: etuva/ pupinel,

- Obiecte de laborator care se sterilizeaza prin caldura uscata:

sticlarie (eprubete, flacoane, cilindrii, baloane, pahare, pipete gradate, pipete

Pasteur, cupe de centrifuga etc),

obiecte din portelan: mojar, pistil,

instrumentar chirurgical,

substante grase,

pulberi termostabile.

- Nu se sterilizeaza la etuva: obiecte din plastic, cauciuc, vata, bumbac,

materiale termolabile, materiale contaminate din laborator etc.

- Sterilizarea prin aer cald se realizeaza la temperatura de 180ºC, timp de 1 ora,

- Timpul total de sterilizare se masoara din momentul in care termometrul indica

atingerea temperaturii de sterilizare (180ºC): timpul de omorare a microbilor (25

min) + timpul de racire (35 min) = timpul total al operatiei (60 min).

- Timpul total al operatiei poate depasi 60 min, in functie de capacitatea etuvei,

sterilizarea unor ambalaje voluminoase, substante care se incalzesc greu, etc.

- Exista etuve automate, cu afisarea continua a parametrilor sterilizarii.

a.2. Sterilizarea prin caldura umeda: este cea mai eficienta metoda de sterilizare si se bazeaza pe mecanismul de coagulare, degradare a proteinelor.

v     Autoclavarea: esentiala pentru orice tip de laborator de microbiologie, pentru unitati sanitare, stomatologie, farmacologie, in sistem public sau privat.

Vaporii de apa realizeaza la 0,5 atm o temperatura de 115ºC (utila pentru sterilizarea mediilor de cultura lichide sau solide, cu zaharuri in compozitie, termosensibile). Timp de sterilizare: 20- 30 min.

La 1 atm se realizeaza o temperatura de 121ºC (sterilizare solutii apoase: ser fiziologic, apa distilata). Timpul de omorare al microorganismelor: 18 min; timpul total de sterilizare depinde de marimea volumelor de sterilizat: 20 – 45 min.

La 2 atm se realizeaza o temperatura de 134 ºC, la care se obtine distrugerea bacteriilor in forme vegetative si sporulate, virusurilor, fungilor, parazitilor. La acesti parametri se sterilizeaza deseurile infectioase rezultate din activitatea zilnica in laboratorul de microbiologie.

Tipuri de autoclave:

autoclave cu perete simplu

autoclave cu manta de abur

autoclave cu pre- si post- vacuum

      Important: evitarea formarii “pungilor de aer”. Prezenta aerului, compromite sterilizarea: vaporii de apa, mai usori, incalzesc partea superioara a incintei, iar aerul, mai greu, ramane in partea inferioara cu temperaturi insuficiente pentru sterilizare.

sistemul de vacuum favorizeaza uscarea finala a materialelor sterilizate,

sistem de racire: previne fierberea violenta a lichidelor si grabeste scaderea presiunii la sfarsitul sterilizarii,

Prin autoclavare se sterilizeaza: solutii, substante, medii de cultura solide, lichide; instrumentar medical (metalic, cauciuc, bumbac, textile etc), sticlarie, materiale contaminate din laborator- deseuri infectioase.

v     Tindalizarea: (sterilizarea fractionata) evita incalzirea la temperaturi > 100ºC. Substantele de sterilizat se incalzesc la temperaturi mai mici de fierbere, timp de 30- 60 min, 3- 8 zile consecutiv. Incalzirile repetate distrug formele vegetative bacteriene fie existente in prima zi, fie rezultate in urma germinarii sporilor existenti, in intervalele dintre incalziri.

metoda este indicata in industria alimentara, sterilizarea unor medii de cultura etc.

v     Pasteurizarea: nu este o metoda de sterilizare, dar se utilizeaza pentru conservarea de scurta durata a alimentelor (lapte, bere).

Sunt distruse formele vegetative, dar nu si formele sporulate.

Exista: pasteurizare joasa: 30min la 56 - 65ºC, pasteurizare medie: 15 min la 65 - 75ºC si pasteurizare inalta: 2 5 min la 85 - 90ºC.

v     Fierberea: se foloseste cand nu dispunem de alta metoda mai eficienta de sterilizare,

in 30 min de la momentul fierberii, sunt distruse formele vegetative, fungii si virusurile, dar nu si sporii.,

eficienta metodei poate fi imbunatatita prin adaugarea de carbanat de sodium 1 – 2 % (scade punctual de fierbere)

b) Sterilizarea prin filtrare: microorganismele pot fi retinute mecanic sau electrostatic in porii unor filtre.

trecerea unei substante lichide prin porii unui filtru, material poros (portelan, pamant de infuzorii, sticla poroasa, membrane filtrante din acetat de celuloza), care vor retine microorganismele existente initial in substanta de filtrat, se numeste sterilizare prin filtrare.

O membrana filtranta cu porozitate 0,022 mm, retine toate bacteriile.

importanta practica: filtrele HEPA utilizate pentru strilizarea aerului din boxele de siguranta biologica cls II- III, cu flux laminar, filtrele HEPA din aparatele de aer conditionat din salile de chirurgie,

alte aplicatii: decontaminarea aerului din incaperi, sterilizarea unor medii de cultura (componente termosensibile, distruse prin autoclavare: glucoza, urea), reactivi, sensibili la sterilizarea prin caldura.

c) Sterilizarea prin intermediul radiatiilor:

- Radiatiile sunt ionizante (X, gamma) si neionizante (UV): efcte bactericide prin ruperea legaturilor de hidrogen, oxidarea dublelor legaturi din structura microorganismelor.

- Lampile generatoare de radiatii UV (tuburi de sticla in care descarcarile electrice in atmosfera de vapori de mercur la joasa presiune, genereaza radiatii UV) se numesc lampi germicide.

- Lungimea de unda germicida: λ = 253,7nm,

- radiatii UV cu λ = 184,9 nm produc ozon, de asemenea cu efect bactericid,

- viata de functionare a unei lampi germicide uzuale, este limitata: aprox 100 ore, dupa care trebuie inlocuita,

- efect germicid maximal, dupa indepartarea mecanica a prafului de pe suprafete, stergere cu carpa inmuiata in alcool sau ammoniac si apa,

- lampile germicide sunt indicate in laboratorul de microbiologie, pentru:

reducerea incarcaturii microbiene din spatiile de lucru,

sterilizarea suprafetelor de lucru,

creearea mediului ambiant steril pentru repartizarea mediilor de cultura in placi Petri, daca laboratorul nu este dotat cu hota de protectie antibacteriana,

diverse manopere care necesita conditii aseptice de lucru.

Radiatiile ionizante se utilizeaza in sterilizari industriale: alimente, medicamente, seringi de unica utilizare etc.

ANTISEPTICE, DEZINFECTANTE

Definitie: sunt substante chimice cu actiune antibacteriana neselectiva, care pot altera structuri si functii comune atat microorganismelor cat si organismelor superioare.

Antisepticele se aplica pe tegumente si mucoase, in timp ce dezinfectantele numai pe suprafete inerte.

Clasificare in functie de mecanismele de actiune:

Substante care denatureaza proteinele:

alcool etilic 70º, acizi, baze,

efect bactericid,

utilizat in practica atat ca antiseptic (tegumente), cat si ca dezinfectant (suprafete de lucru),

Substante care oxideaza gruparile chimice libere ale enzimelor :

hipermanganat de potasiu 1 ‰ (antiseptic pentru mucoase),

peroxid de hidrogen 3% in apa (antiseptic pentru plagi),

halogenii (Cl2, Br2, I2): hipocloriti, cloramina, iodura de potasiu/ solutie lugol,

Substante care lezeaza membranele celulare:

fenoli,

detergenti anionici (sapunuri, detergenti),

detergenti cationici (saruri cuaternare de amoniu: bromocet),

Substante care altereaza acizii nucleici:

coloranti bazici: violet de gentiana, albastru de metilen, fucsina bazica,

derivati de acridina: rivanol

Nu exista un dezinfectant ideal.

Exemple de dezinfectanti mai frecvent utilizati:

Ø      Hipocloritii:

preparare periodica (se inactiveaza > 24 ore),

concentratia de clor stabilita in functie de scopul urmarit,

au efect germicid pe forme bacteriene vegetative (inclusiv Mycobacterium tuberculosis), sporulate, fungi, virusuri,

efectul diminuat de prezenta substantelor organice (proteine: albumina), pe substrat din mase plastice, in prezenta detergentilor etc,

coroziv pe suprafete metalice,

iritant pentru piele, ochi, cai respiratorii,

Ø      Derivati fenolici:

fenolii nu se folosesc ca atare, datorita toxicitatii, potentialului carcinogen, corozivitatii, ci sub forma de derivati,

preparare periodica (inactivare in 24 ore),

concentratia de 2-5 %,

efect germicid pe forme bacteriene vegetative (inclusiv Mycobacterium tuberculosis), sporulate, fungi, unele virusuri,

ineficienti pe forme sporulate, pe unele virusuri nude,

nu sunt inactivati de proteine,

eficienta scade pe suprafete de cauciuc, lemn, material plastic,

Ø      Glutaraldehida:

efect antimicrobian foarte bun (inclusiv pe virusurile hepatitice B si C), cu indicarea unui timp de expunere mai mare pentru Mycobacterium tuberculosis,

efect neinfluentat de proteine, se utilizeaza in solutii 2%, alcaline,

indicata pentru dezinfectarea suprafetelor metalice pe care nu le corodeaza,

iritanta pentru ochi, mucoasa respiratorie,

Ø      Iodoforii:

substante care elibereaza iodul lent, in solutii apoase, cu efect germicid asupra bacteriilor,(inclusiv Mycobacterium tuberculosis), fungilor, sporilor bacterieni, virusurilor cu invelis lipidic,

inactivati de substanmte organice, mase plastice, detergenti anionici.

Recomandati pentru dezinfectia pipetelor, suprafetelor, antiseptizarea mainilor .