Toxicitatea acuta la pesti

TOXICITATEA ACUTA LA PESTI

1. METODA

1.1. INTRODUCERE

Scopul acestui test este de a determina toxicitatea letala acuta a unei substante la pestii de apa dulce. Este de dorit sa avem, pe cat este posibil, informatii legate de solubilitatea in apa, presiunea de vapori, stabilitatea chimica, constantele de disociere si biodegradabilitatea substantei pentru a ne ajuta la alegerea celei mai adecvate metode de testare (statica, semistatica sau dinamica) si pentru a asigura concentratii constante satisfacatoare ale substantei de testat pe durata testarii.

Atat la planificarea testului, cat si la interpretarea rezultatelor trebuie luate in considerare informatiile suplimentare (de exemplu: formula structurala, gradul de puritate, natura si procentul de impuritati semnificative, prezenta si cantitatea de aditivi si coeficientul de distributie n-octanol/apa).

1.2 DEFINITII SI UNITATI DE MASURA

Toxicitatea acuta este efectul advers vizibil indus intr-un organism intr-o perioada scurta de timp (zile) de expunere la o substanta. In testul de fata, toxicitatea acuta este exprimata drept concentratia letala medie (CL₅₀), care este concentratia substantei de testat in apa care omoara 50% din lotul de pesti testat intr-o perioada continua de expunere, care trebuie stabilita.

Toate concentratiile substantei de testat se exprima in greutate pe volum (mg/l). Ele pot fi de asemenea exprimate ca greutate pe greutate (mg.kg^-1).

1.3. SUBSTANTE DE REFERINTA

O substanta de referinta poate fi testata ca un mijloc de a demonstra ca in conditiile de testare din laborator raspunsul speciilor testate nu s-a schimbat semnificativ.

Nu se specifica substante de referinta pentru acest test.

1.4. PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE

Se poate efectua un test limita la 100 mg/l pentru a demonstra ca CL₅₀ este mai mare decat aceasta concentratie.

Pestii sunt expusi substantei de testat solubilizata in apa, intr-o serie de concentratii, pe o perioada de 96 ore. Se inregistreaza mortalitatea la intervale de cel putin 24 ore si se calculeaza concentratiile care omoara 50% din pesti (CL₅₀) la fiecare perioada de observare, pe cat posibil.

1.5.CRITERII DE CALITATE

Criteriile de calitate se aplica testului limita precum si metodei testului complet. Mortalitatea in testele de control nu trebuie sa depaseasca 10% (sau un peste daca se folosesc mai putin de 10 pesti) pana la sfarsitul testului.

Concentratia de oxigen dizolvat trebuie sa fie tot timpul mai mare de 60% din valoarea de saturatie cu oxigen.

Concentratiile substantei de testat se mentin in limita a 80% din concentratiile initiale pe toata durata testului.

Pentru substantele care se dizolva usor in apa de dilutie, rezultand solutii stabile adica acelea care nu se volatilizeaza, degradeaza, hidrolizeaza sau adsorb intr-o masura mare, concentratia initiala poate fi considerata echivalenta cu concentratia nominala. Se va face dovada ca concentratiile au fost mentinute pe toata durata testului si ca criteriile de calitate au fost satisfacute.

Pentru substantele care sunt:

i). putin solubile in solutia de testare, sau

ii). capabile sa formeze emulsii stabile sau dispersii, sau

iii).instabile in solutii apoase,

concentratia initiala va fi considerata drept concentratia determinata analitic in solutie (sau, daca nu este posibil tehnic, masurata in coloana de apa) la inceputul testului.

Concentratia se determina dupa o perioada de echilibrare, dar inainte de introducerea pestilor pentru testare.

In oricare din aceste cazuri, trebuie sa se efectueze determinari in timpul testarii pentru a confirma concentratiile reale de expunere sau respectarea criteriilor de calitate.

Valoarea pH-ului nu trebuie sa varieze cu mai mult de o unitate.

1.6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE

Se pot folosi trei tipuri de metode:

Metoda statica:

Test de toxicitate in care nu se produce inlocuirea solutiei de testat (solutiile raman nemodificate pe toata durata testului).

Metoda semistatica

Testare fara inlocuirea continua a solutiei de testat, dar cu inlocuirea regulata a acesteia dupa anumite perioade (de exemplu, 24 ore).

Metoda dinamica

Testul de toxicitate in care solutia de testat este reinnoita constant in vasele de testare, substanta chimica testata fiind trasportata cu apa utilizata pentru a reinnoi solutia de testat.

1.6.1.Reactivi

1.6.1.1.Solutiile substantelor de testat

Solutiile stoc de concentratia necesara sunt preparate prin dizolvarea substantei in apa deionizata sau in apa conform pct.1.6.1.2.

Concentratiile de testat alese sunt preparate prin diluarea solutiei stoc. Daca sunt testate concentratii mai ridicate, cantitati corespunzatoare din substanta de testat poat fi solubilizate direct in apa de dilutie.

Substantele trebuie in mod normal sa fie testate numai pana la limita solubilitatii.

Pentru unele substante (de exemplu: substantele putin solubile in apa, sau cele cu P_ow ridicat, sau care formeaza dispersii stabile in loc de solutii apoase reale), se accepta sa se foloseasca o concentratie de testat deasupra limitei de solubilitate a substantei pentru a fi siguri ca s-a obtinut concentratia maxima solubila/stabila. Este totusi important ca aceasta concentratie sa nu perturbe sistemul de testare (de exemplu, o pelicula de substanta pe suprafata apei care sa impiedice oxigenarea apei, etc).

Pentru a prepara solutiile stoc ale substantelor cu solubilitate scazuta in apa sau pentru a ajuta dispersia acestor substante in apa de dilutie se pot folosi: dispersia cu ultrasunete, solventi organici, emulgatori sau agenti de dispersie. Cand se folosesc astfel de substante auxiliare, toate solutiile de testat trebuie sa contina aceeasi cantitate de substanta auxiliara, iar pestii de control trebuie sa fie expusi la aceeasi concentratie a substantei auxiliare ca cea folosita in seriile de testare. Concentratia unor astfel de substante auxiliare trebuie minimalizata, si in nici un caz nu trebuie sa depaseasca 100 mg/l.

Testul trebuie efectuat fara ajustarea pH-ului. Daca exista dovada unei schimbari pronuntate a pH-ului se recomanda ca testarea sa se repete dupa ajustarea pH-ului, iar rezultatele trebuie raportate. In acest caz, valoarea pH-ului solutiei stoc ar trebui ajustata la valoarea pH-ului apei de dilutie, daca nu exista alte indicatii specifice. Pentru ajustarea pH-ului sunt preferate HCl si NaOH. Aceasta ajustare a pH-ului trebuie sa fie facuta astfel incat concentratia substantei de testat din solutia stoc sa nu se schimbe in mod semnificativ. Daca in urma acestei corectii de pH are loc o reactie chimica sau precipitarea fizica a substantei de testat, acest lucru trebuie raportat.

Apa de dilutie si prepararea solutiilor

Se poate folosi ca apa de dilutie apa potabila (necontaminata de concentratii potential daunatoare de clor, metale grele sau alte substante), apa naturala de calitate buna sau apa reconstituita (a se vedea Anexa 1). Este preferata apa cu o duritate totala intre 10 si 250 mg/l ca (CaCO₃) si cu un pH in intervalul 6,0 - 8,5.

Aparatura

Toata aparatura trebuie confectionata din material inert din punct de vedere chimic:

sistem automat de diluare (pentru testare in conditii dinamice)

oxigenometru

echipament pentru determinarea duritatii apei

aparatura adecvata pentru controlul temperaturii

pH-metru

1.6.3. Pestii de testare

Pestii trebuie sa fie sanatosi si fara malformatii vizibile.

Speciile folosite trebuie sa fie selectate pe baza criteriilor practice cum ar fi: disponibilitatea lor tot timpul anului, posibilitatea de intretinere usoara, usurinta pentru testare, sensibilitatea relativa la substante chimice si orice factori economici si biologici sau ecologici care au vreo importanta. La selectarea speciilor de pesti se va tine seama de necesitatea comparabilitatii datelor obtinute si de armonizarea internationala existenta (Referinta 1).

Lista speciilor de pesti care sunt recomandate pentru efectuarea acestui test este prezentata in Anexa 2; pestele zebra si pastravul curcubeu sunt speciile preferate.

1.6.3.1. Intretinerea

Pestii de testare de preferinta trebuie sa apartina unui singur lot, sa aiba lungime si varsta similare. Pestele trebuie intretinut cel putin 12 zile in urmatoarele conditii:

Popularea bacurilor:

- adecvata sistemului (recirculare sau in conditii dinamice) si speciilor de peste

Apa:

- a se vedea 1.6.1.2.,

Lumina:

- iluminare zilnica 12 -16 ore,

Concentratia oxigenului dizolvat:

- cel putin 80% din valoarea de saturatie cu oxigen

Hranirea:

- de 3 ori pe saptamana sau zilnic, cu o pauza de 24 ore inainte de pornirea testarii.

1.6.3.2 Mortalitatea

Dupa o perioada de 48 ore, se inregistreaza mortalitatea si se aplica urmatoarele criterii:

mai mare de 10% din populatie in 7 zile: => respingerea intregului lot

intre 5 si 10 % din populatie: => perioada de intretinere continua inca 7 zile. Daca nu mai apare mortalitate, lotul este acceptat, iar altfel este respins

mai putin de 5 % din populatie: => acceptarea lotului

1.6.4. Adaptare

Toti pestii trebuie expusi intr-o apa cu o calitate si temperatura similare cu cele ale apei folosite pentru dilutie cel putin 7 zile inainte de a fi folositi.

1.6.5. Procedeul de testare

Un test preliminar poate preceda testul final pentru a obtine informatii legate de intervalul de concentratii ce vor fi folosite in testul final.

In plus fata de testare propriu-zisa, se efectueaza un test de control fara substanta de testat si daca este relevant, inca un test de control pentru substanta auxiliara.

In functie de proprietatile fizice si chimice ale substantei de testat, se alege metoda adecvata statica, semistatica sau dinamica, pentru a indeplini criteriile de calitate.

Pestii sunt expusi substantei conform celor descrise mai jos:

durata: 96 ore

numarul de organisme test: cel putin 7 pe concentratie

vase: de capacitate adecvata in functie de greutatea recomandata a lotului

greutatea lotului testat: este recomandata greutatea maxima de 1 g/l pentru testele
statice si semistatice; pentru testele in conditii dinamice
se accepta o greutate mai mare

concentratia de testat: cel putin 5 concentratii care difera printr-un factor constant care
nu depaseste 2,2 si pe cat posibil intr-o gama de 0 -100%
mortalitate

apa: a se vedea 1.6.1.2.

lumina: 12-16 ore lumina zilnic

temperatura: conform speciei (Anexa 2) dar in limita ± 1sC in cadrul fiecarei testari.

concentratia de oxigen dizolvat : nu mai putin de 60% din valoarea de saturatie cu
    oxigen la temperatura selectata

hranire: nu se administreaza hrana

Pestii sunt observati dupa primele 2 pana la 4 ore si la intervale de cel putin 24 ore.

Pestele este considerat mort daca atingerea pedunculului codal nu produce nici o reactie si nu sunt vizibile miscari de respiratie. Pestii morti sunt scosi atunci cand sunt observati si se inregistreaza mortalitatea.

Se tine evidenta comportamentului anormal vizibil (de exemplu, pierderea echilibrului, schimbarea comportamentului de inot, functia respiratorie, pigmentarea, etc).

Trebuie efectuate zilnic masuratori ale pH-ului, oxigenului dizolvat si a temperaturii.

Testul limita

Folosind procedurile descrise in aceasta metoda de testare, se poate efectua un test limita la 100 mg/l pentru a demonstra ca CL₅₀ este mai mare decat aceasta concentratie.

Daca natura substantei nu permite atingerea concentratiei de 100 mg/l in solutia de testat, testul limita trebuie sa fie efectuat la o concentratie egala cu solubilitatea substantei (sau concentratia maxima pentru formarea unei dispersii stabile) in mediul folosit (a se vedea si punctul 1.6.1.1.).

Testul limita trebuie efectuat folosind intre 7 si 10 pesti, cu acelasi numar de teste de control. (Teoria Binomului spune ca daca se folosesc 10 pesti si mortalitatea este 0, exista 99,99% increderea ca CL₅₀ este mai mare decat concentratia folosita in testul limita. Cu 7, 8 sau 9 pesti, absenta mortalitatii asigura cel putin 99 % incredere ca CL₅₀ este mai mare decat concentratia folosita).

Daca apare mortalitate trebuie sa se efectueze un studiu complet. Daca se observa efecte subletale acestea trebuie inregistrate.

DATE SI EVALUARE

Pentru fiecare perioada in care s-au inregistrat observatii (24, 48, 72 si 96 ore) se reprezinta grafic mortalitatea exprimata in procente, in functie de concentratie, pe o hartie logaritmica.

Cand este posibil, pentru fiecare perioada de observare, trebuie sa se estimeze CL₅₀ si limitele de incredere (p=0,05) folosind procedeele standard; aceste valori trebuie rotunjite la 1 sau cel mult 2 cifre semnificative (exemple de rotunjire la 2 cifre: 170 pentru 173,5; 0,13 pentru 0,127; 1,2 pentru 1,21).

In cazul in care panta curbei de raspuns concentratie/procentaj este prea abrupta pentru a permite calcularea lui CL₅₀, este suficienta estimarea grafica a acestei valori.

Cand doua concentratii consecutive intr-un raport de 2,2 dau numai 0 si 100% mortalitate, aceste doua valori sunt suficiente pentru a indica intervalul in care se situeaza CL₅₀.

Daca se observa ca stabilitatea sau omogenitatea substantei de testat nu pot fi mentinute, acest lucru trebuie raportat si interpretarea rezultatelor trebuie facuta cu grija.

RAPORTAREA

Raportul de testare va include, daca este posibil, urmatoarele informatii:

informatii despre pestii de testare (denumirea stiintifica, specia, furnizorul, orice

pretratare, dimensiunea si numarul folosit pentru fiecare concentratie de testat);

sursa apei de dilutie si caracteristicile chimice principale (pH, duritate, temperatura);

in cazul unei substante putin solubile in apa, metoda de preparare a solutiei stoc si a solutiilor de testat;

concentratia oricaror substante auxiliare;

lista concentratiilor folosite si orice informatii disponibile legate de stabilitatea substantelor chimice testate la concentratiile din solutia de testat;

daca sunt efectuate analizele chimice, metodele folosite si rezultatele obtinute;

rezultatele testului limita daca este efectuat;

motivele alegerii si detaliile metodei de testare folosite (de exemplu: statica, semistatica, raportul de dozare, viteza curgerii, conditiile de aerare, greutatea lotului de pesti testat, ect);

descrierea echipamentului de testare;

regimul de iluminare;

concentratiile de oxigen dizolvat, valorile pH-ului si temperaturilor solutiilor de testat la fiecare 24 ore;

dovada indeplinirii criteriilor de calitate;

tabelul care prezinta mortalitatea cumulata pentru fiecare concentratie testata si inregistrarile aferente controlului (inclusiv pentru testul de control cu substanta auxiliara, daca este cazul) la fiecare perioada de observare recomandata;

graficul curbei de raspuns concentratie/procentaj la sfarsitul testarii;

daca e posibil, valorile CL₅₀ la fiecare perioada de observare recomandata (cu limite de incredere de 95%);

procedeele statistice folosite pentru determinarea valorilor CL₅₀;

rezultatele obtinute, daca s-a folosit o substanta de referinta;

cea mai ridicata concentratie de testat care nu provoaca mortalitate in timpul perioadei de testare;

cea mai scazuta concentratie de testat care provoaca mortalitate 100% in timpul perioadei de testare;

4. BIBLIOGRAFIE

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C (81) 30 final and updates.

AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985

AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985

ISO 7346/1, /2 and /3 - Water quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan -Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: semi-satic method. Part 3: Flow - through method

Eidgenössisches Department des Innern, Schweiy: Richtlinien fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden-Part II 1974

DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15)

JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980

Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicty tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975

Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978

Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 march 1979

Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975

Commission of the Eurpean Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368,22 March 1979

Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje,R. Okotoxikologie, Grundlagen fur die okotoxikologische Bewertung von

Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986

Litchfield, J.T and Wilcoxon, F.A. simplified method for evaluating dose effects experiments, J.Pharm Exp. Therap, 1949, vol 96,99

Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay, Griffin, Waycombe, U.K. 1978

Sprague J.B., Measurement of pollutant toxicity to fish, Bioassay methods for acute toxicity, Water Res., 1969, vol 3, 793-821

Sprague J.B., Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol4, 3-32

Stephan C.E, Methods for calculating an LC₅₀. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84

Stephan C.E, Busch K.A, Smith R., Burke, J. and Andrews R.W. A computer program for calculating an LC₅₀. US EPA.

Anexa 1

Apa reconstituita

Exemplu pentru o apa de dilutie adecvata

Toate substantele chimice trebuie sa fie de calitate analitica.

Apa trebuie sa fie apa distilata de calitate buna, sau apa deionizata cu o conductibilitate mai mica de 5 µScm^-1.

Aparatura pentru distilarea apei nu trebuie sa contina nici o piesa din cupru.

Apa de dilutie reconstituita

Se adauga cate 25 ml din cele 4 solutii stoc si se completeaza pana la 1 litru cu apa.

Se aereaza pana cand concentratia oxigenului dizolvat este egala cu valoarea de saturatie cu oxigen.

pH-ul trebuie sa fie 7,8 ± 0,2.

Daca este necesar se ajusteaza pH-ul cu NaOH (hidroxid de sodiu) sau HCl (acid clorhidric).

Apa de dilutie preparata astfel este lasata in repaos cca. 12 ore si nu mai trebuie aerata.

Suma ionilor de Ca si Mg in aceasta solutie este 2,5 mmol / l. Raportul ionilor Ca:Mg este 4:1 si al ionilor Na:K este 10:1.Alcalinitatea totala a acestei solutii este 0,8 mmol /l.

Orice modificare a prepararii apei de dilutie nu trebuie sa schimbe compozitia sau proprietatile apei.

Anexa 2

Speciile de pesti recomandate pentru testare

Colectare:

Pestii din lista de mai sus sunt usor de crescut si/sau se gasesc din abundenta in tot timpul anului. Pot fi crescuti si inmultiti in crescatoriile de pesti sau in laborator, in conditii controlate de boala si paraziti astfel incat animalele de testare sa fie sanatoase si cu ascendenta cunoscuta. Acesti pesti sunt disponibili in multe locuri ale lumii.

Anexa 3

Exemplu de inregistrare grafica: concentratie / procentul de mortalitate

Exemplu de determinare a CL₅₀ folosind hartia logaritmica.