DIAGNOSTICUL IN LOCA AMERICANA LA PUIETUL DE ALBINE PRIN EXAMEN BACTERIOSCOPIC

PROCEDURA SPECIFICA

DIAGNOSTICUL IN LOCA AMERICANA LA PUIETUL DE ALBINE PRIN EXAMEN BACTERIOSCOPIC

CAP. 1. SCOP. DOMENIU DE APLICARE

SCOP

Prezenta procedura se utilizeaza pentru identificarea sporilor bacteriei Bacillus larvae WHITE, prin examen bacterioscopic, in frotiuri colorate Gram executate din fagure cu puiet capacit cu semne clinice de boala, sau din fagure cu detritusuri larvare.

DOMENIU DE APLICARE

Procedura se aplica in cadrul Compartimentului de Sanatate Animala pentru probele de puiet de albine, receptionate si procesate in cadrul sectiei de Bacteriologie a LSVSA Cluj.

CAP. 2. DOCUMENTE DE REFERINTA SI CONEXE

DOCUMENTE DE REFERINTA

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2004, Part 2, Section 2.9, Chapter 2.9.2

*** Catalog National al metodelor omologate de diagnostic paraclicnic veterinar, Metoda cod 1.14.

PG-L-01: Controlul documentelor

PG-L-02: Analiza cererilor de oferta, ofertei si contractelor

PG-L-07: Controlul inregistrarilor

PG-L-10: Controlul echipamentelor de analiza

PG-L-11:Managementul probelor:

PG-L14: Localuri, conditii de mediu si protectia personalului

PG-L-15: Executia analizelor si asigurarea calitatii rezultatelor analizelor:

PG-L-16: Controlul datelor

DOCUMENTE CONEXE

IL-LBT-05 - Instructiune de lucru Microscop tip Olympus model CHS, seria 4A0274, nr. inv. 3017

IL-LBT-11- Intructiune de lucru frigider Arctic, nr. inventar 2168

IL-LBT-06- Instructiune de lucru Hota cu flux laminar Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183

CAP. 3. DEFINITII SI ABREVIERI

DEFINITII

Loca americana afecteaza stadiul larvar al albinelor Apis mellifera si alte specii ale genului Apis, ce exista in intreaga lume si este produsa de Paenibacillus larvae subspecia larvae.

Paenibacillus larvae subspecia larvae poate produce peste 1 miliard de spori in fiecare larva infectata. Sporii sunt extrem de rezistenti la caldura si la agentii chimici si numai acestia sunt capabili sa induca boala.

ABREVIERI

MC MANUALUL CALITATII;

PG – PROCEDURA GENERALA DE SISTEM;

PO - PROCEDURA OPERATIONALA;

PS – PROCEDURA SPECIFICA DE INCERCARE ;

IL – INSTRUCTIUNI DE LUCRU ;

SC – SISTEMUL CALITATII ;

AC – ASIGURAREA CALITATII;

HG - HOTARARE GUVERNAMENTALA;

AI – AUDITUL INTERN ;

LBT – LABORATOR ANALIZE MICROBIOLOGIE ALIMENTARA;

BA – BULETIN DE ANALIZE ;

RAC – RESPONSABIL ASIGURAREA CALITATII;

EIMI – ECHIPAMENTE INCERCARE ;

DC - DOCUMENTELE CALITATII

RTL - RESPONSABILUL TEHNIC DE LABORATOR

CAP. 4. DESCRIEREA ACTIVITATII PROCEDURATE

CONDITII PREALABILE

Modul de analiza, acceptare si inregistrare a cererilor de incercare (analiza) este conform MC si PG-L-02

Receptia, verificarea, circuitul, inscriptionarea si esantionarea probelor de analizat se face conform MC si PG-L-11.

Protectia personalului

Este obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de protectie si a bonetei.

Deoarece suspensiile obtinute din probele ce urmeaza a fi analizate analizate, culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic, cat si culturile microbiene martor folosite sunt potential contaminante, manipularea acestora se va face cu maxima precautie.

Pentru a se evita ingerarea materialului potential patogen, pipetele folosite in procesul analitic se vor asigura cu dop de vata. Dupa utilizare, pipetele se vor depune in recipiente din sticla cu solutie dezinfectanta.

Protectia mijloacelor de incercare si/sau masurare

Toata sticlaria care se foloseste in aceasta determinare se pastreaza numai sterilizata, in dulapuri sau sertare speciale, pentru a evita prafuirea, contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate.

Verificarea starii de functionare si confirmare metrologica a mijloacelor de masurare si/sau incercare

Se verifica starea tehnica a sticlariei care se va folosi la determinare.

Nu se vor utiliza mijloace de masurare a caror perioada de valabilitate metrologica este depasita, care nu functioneaza la parametrii corespunzatori sau care nu se incadreaza in clasa de precizie impusa de standardul de lucru.

Lampa bacteriologica-UV se verifica pentru eficienta sterilizarii prin teste de sanitatie de pe suprafetele asupra carora a actionat.

RESURSE NECESARE

ECHIPAMENTE DE INCERCARE SI MIJLOACE DE MASURARE

Autoclav RAYPA AES – 75, seria 17084, nr. inv. 2260 -IL-LBT

Microscop tip Olympus model CHS, nr. 4A0274, nr. inv. 3017     - IL-LBT-05

Hota cu flux laminar tip Optofina, Bucuresti, nr. Inv. 2183 - IL-LBT

Frigider

MATERIALE SI STICLARIE DE LABORATOR

placi Petri sterile, cu diametrul de 90 mm;

pipete Pasteur sterile;

lame microscop;

anse bacteriologice cu bucla cu diametru de aprox. 3 mm, din nichel-crom si/sau ace de insamantare si baghete sterile;

lame microscopice;

pense/spatule;

recipiente cu solutie decontaminanta pentru depozitarea pipetelor Pasteur dupa utilizare;

bisturiu;

foarfeca;

pensa anatomica;

pensa oftalmologica;

bec Bunsen;

manusi chirurgicale;

MEDII DE CULTURA SI REACTIVI

violet de Gentiana sol.1%;

fuxina sol 1‰;

alcool etilic p.a. acetona;

sol Lugol;

apa distilata;

ulei de cedru;

toluen sau benzen

eter.

EXECUTIA ANALIZEI, ACTIVITATII

Pregatirea probelor se realizeaza de catre personalul executant de incercare sub supravegherea responsabilului de incercare.

Probele supuse examinarii sunt reprezentate de fragmente de cca. 20 cm fagure cu puiet capacit, cu modificari anatomopatologice caracteristice.

a.        Aspectul general al fagurelui cu puiet

Aspectele de “ puiet imprastiat” si “puiet pestrit” al fagurelui sunt datorate alternantei dintre zonele compacte cu celule capacite si zonele cu celule necapicite si respectiv aspectului datorat scufundarii, perforarii si culorii modificate a capacelelor sub care se afla larvele bolnave. Din galben- maroniu, culoarea capacelelor devine din ce in ce mai inchisa spre maroniu-negru. Din plate sau usor bombate, capacelele se escaveaza si sunt perforate. Fagurii afectati de loca americana exhala un miros carcateristic de putrefactie.

b.        Aspectul larvelor bolnave

Larvele afectate, din alb-sidefiu devin galbene si apoi maro-ciocolatiu, transformandu-se totodata intr-o masa vascoasa aderenta la peretii celulei, care, in momemtul in care se incearca extragerea ei din celula, se formeaza un filament de 2-3 cm lungime.

Dupa o luna sau mai mult, larvele moarte se deshidrateaza complet luand aspectul unui detritus maro-inchis spre negru, puternic aderent la peretele inferior al celulei.

Pentru determinare se folosesc mijloace de masurare si/sau incercare prevazute la

identificarea agentului

Din larva filanta sau din detritusul larvar uscat, se preleveaza o mica parte care se omogenizeaza bine intr-o picatura de apa distilata pe o lama de sticla; se lasa sa se usuce, se fixeaza la flacara, se coloreaza dupa tehnica clasica Gram si se examineaza la microscop cu obiectiv de imersie.

Calculul rezultatelor si modul de exprimare al acestora

Evidentierea in campul microscopic a sporilor de forma ovala, cu marginile colorate intens si centrul incolor, de diemnsiuni cuprinse intre 0,6-0,7 microni latime si 1,1-1,3 microni lungime, specifici P.larvae, permite stabilirea diagnosticului de loca americana.

Uneori in campul microscopic se pot observa si forme vegetative ale germenului, bacili Gram pozitiv, capete rotunjite, de 1,5-5 microni lungime si 0,5-0,6 microni latime, in curs de sporulare. In aceste cazuri sporul este asezat central sau subterminal si deformeaza corpul bacterian.

surse potentiale de incertitudine:

A. Probe:

Recoltare;

Ambalare;

Transport;

Manipulare;

Esantionare;

Individualizare;

Omogenitate;

Stabilitate;

B. Personal:

Abilitati personale;

Instruire/experienta;

C. Echipament:

Utilizare;

Calibrare;

Mentenanta;

Service asigurat;

D. Metoda:

Mod de descriere;

Materiale documentare de referinta;

Existenta controlului in punctele critice;

E. Materiale utilizate:

Medii de cultura;

Solutii pentru colorare;

Consumabile;

Sticlarie;

F. Conditii de mediu:

Temperatura;

Conditii de sterilitate.

CAP. 5. ACTIVITATI FINALE

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Conform rezultatului examenul bacterioscopic se mentioneaza in fisa de diagnostic bacteriologic (FL-LBT-01) precum si in rubrica Rezultat a Buletinului de Analiza (FG-L-13-01) pozitiv/ negativ pentru Loca Americana.

CAP. 1. RESPONSABILITATI

Limite de autoritate

Pentru executarea in bune conditii a prezentei proceduri limitele de autoritate sunt:

Responsbalitati

Director Executiv

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura.

Sef de Laborator

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza.

Sef Birou Sanatate Animala

aproba cererea de analiza si primirea probei pentru incercare,

valideaza rapoartele de incercare prin semnatura si coraboreaza datele prezentate in buletinul de analiza,

verifica prin sondaj, rezultatele incercarilor

Responsabilul de incercare

supervizeaza executia incercarii;

raspunde de corectitudinea executiei;

elaboreaza opinii si interpretari asupra rezultatelor inscrise in buletinul de analiza, prin compararea cu reglementari si normative in vigoare,

redacteaza buletinele de analiza, cu observatiile si concluziile aferente;

valideaza executia incercarii;

confirma rezultatul prin semnatura.

verifica nutritivitatea si selectivitatea mediilor de cultura;

gestioneaza tulpinile de referinta

Executantii de analiza

inregistreaza proba in registrul de analiza;

completeaza fisele analitice ale probelor si toate inregistrarile calitatii referitoare la incercarea din prezenta procedura specifica

inregistreaza in fisele de temperaturi ale aparatelor valorile citite

executa sub supravegherea specialistilor operatiile de pregatire a probelor;

executa incercarea conform regulilor din procedura specifica;

verifica functionarea mijloacelor de masurare si/sau incercare;

pregatesc si aseptizeaza spatiile si suprafetele de lucru;

conditioneaza si verifica starea sticlariei utilizata in incercare;

tehnoredacteaza buletinul de analiza

comunica responsabilului de incercare orice problema aparuta in timpul operatiilor efectuate;

CAP. 2. INREGISTRARI

Registru unic primire probe diagnostic cod R-L-11-1

Registru de diagnostic Necropsic si Bacteriologic cod R-L-11-55

Buletin de analiza FG-L-13-01

fisa de diagnostic bacteriologic FL-LBT-01

fisa de evidenta a materialelor sterilizate la etuva FL-LBT-56

fisa preparare si aprovizionare cu solutii FL-LBT-58

fisa pentru evidenta autoclavarii infectelor FL-LBT-60

fisa interna de gestionare a deseurilor din laboratoare FO-L-08-09