Metode folosite pentru examenul citologic in microscopie

Metode folosite pentru examenul citologic in microscopie

Examinarea morfo-func ionala a celulelor se face pe preparate microscopice. Un preparat microscopic este realizat func ie de scopul analizei si anume: pot fi preparate proaspete sau temporare (extemporanee) i preparate permanente sau fixate.

Pentru realizarea unui preparat sunt efectuate mai multe etape ce necesita respectarea tehnicilor de lucru.

Recoltarea se efectueaza prin:

biopsie (prelevarea de esut )

punc ie bioptica (se ob in fragmente din esut cu ajutorul unui tub numit trocar (exp: punc ie sternala de maduva hematopoietica, punc ie hepatica, renala, ganglionara)

aspira ie endoscopica (exp. Endoscopie gastrica)

punc ia cavita ilor (in cazul unor secre ii de lichide pleurale, peritoneale etc.)

raclarea mucoaselor

prelevarea intraoperatorie

recoltarea de la cadavre sau organisme folosite la experimente.

Se folosesc pense fine care sa nu altereze preparatul , materialul recoltat se pune intr-o placa de pvc.

(a)             Fixarea este o etapa foarte importanta in realizarea de preparate permanente i are ca scop conservarea constituien ilor celulari intr-o stare cat mai apropiata de cea vie. Principalii constituien i ai celulelor fiind proteinele ca urmare,     se are in vedere folosirea unui fixator al proteinelor. Mecanismul fixarii proteinelor nu este perfect cunoscut. Se cunoa te faptul ca, fixatorii histologici determina o coagulare sau o insolubilizare a proteinelor i in majoritatea cazurilor un anumit grad de polimerizare a acestor elemente organice.

Fixatorul citologic trebuie sa indeplineasca urmatoarele calita i:

Sa patrunda rapid in esut;

Sa produca o retrac ie cat mai mica a pieselor evitand modificarea taliei, formei i a raporturilor dintre celule;

Sa permita o buna includere;

Sa permita o buna colorare a structurilor a caror eviden iere se dore te;

Fixarea se realizeaza prin:

(a)    Fixarea cu agen i fizici

sunt metode care folosesc caldura, desicarea la temperaturi scazute (congelare- desicare sau criodesicare), desicarea la temperatura laboratorului;

Metode care presupun o racire a preparatului biologic urmata de ac iunea unui fixator lichid (congelare -sub iere);

Racirea este unul din preocedeele de fixare, avand ca efect oprirea autolizei celulare;

(b)   Fixarea cu agen i chimici

Fixatorii chimici sunt clasifica i func ie de modul in care ac ioneaza asupra proteinelor (asupra modului in care reduc denaturarea proteinelor, schimbarea solubilita ii acestora, lan urile de proteine sunt depliate, care duce la formarea de legaturi noi ce confera ansamblului o anumita rigiditate; o serie de grupari pot deveni active in timp ce altele sunt mascate. Fenomenul denaturarii proteinelor este un fenomen neuniform i destul de greu de prevazut.

Exista 2 tipuri de fixatori folosi i func ie de ac iunea lor (floculare sau coagulare) asupra ovalbuminei: coagulan i (metanolul, etanolul, acetona, acid nitric, acid clorhidric, trioxidul de crom) i necoagulan i (acid acetic, tetraoxid de osmiu, bicromat de potasiu, formaldehida).

Se va lua in considerare i ac iunea lor asupra glucidelor i lipidelor tisulare, gradul de penetrare in interiorul pieselor, retrac ia esuturilor, modificarile organitelor.

Alegerea unui fixator se face inand cont de: natura esutului, detaliile de structura pe care trebuie sa le eviden iem, colora ia pe care vrem sa o facem.

Regulile de fixare de care trebuie sa se ina cont:

evitarea alterarilor autolitice

spalarea cu solu ie fiziologica a fragmentelor inainte de fixare

- manevrarea rapida a materialului

- taierea unor fragmente cat mai mici, facilitarea a penetrarii fixatorului (fragmentul de tesut se pune in flacoane mari cu fund plat si se agita continuu

-se foloseste un volum de regula de 40 x mai mare decat volumul piesei.

- nu se refolosesc fixatorii

- durata fixarii depinde de compozi ia amestecului, structura i dimensiunile pieselor.

Spalarea pentru indepartarea excesului de fixator se face func ie de fixator folosit. Pentru fixatorul formaldehida se folose te apa, pentru dicromat de potasiu se folose te alcool, pentru amestecul Carnoy se folose te alcool absolut.

Includerea

Piesele dupa fixare sunt procesate pentru efectuare sec iunilor. Pentru aceasta se folosesc substan e care se solidifica i care permit ob inerea de sec iuni foarte fine (3-10µm). Cea mai importanta dintre acestea este parafina. Alte substan e folosite sunt: celoidina, gelatina, ra inile sintetice.

Includerea in parafina se realizeaza in mai multe etape:

Deshidratarea - ce consta in trecerea materialului prin mai multe bai de alcool de concentra ii diferite (70%, 95%, 100%), timp de 2-3 ore. Alcoolul va inlocui treptat apa din esutul de analizat.

Clarificarea este etapa de inlocuire a alcoolului cu substan e miscibile cu alcoolul i parafina (xilen, benzen, toluen, cloroform). Procesul se va face prin trecerea in bai succesive cu aceea i substan a, de obicei se foloses te o succesiune de 3 bai de xilen de 1-6 ore func ie de marimea fragmentului.

Impregnarea in parafina se utilizeaza parafina cu punct de topire 56⁰C. Se trec sec iunile prin trei bai de parafina.

Includerea propiu-zisa consta in introducerea intr-o forma cu parafina.se solidifica la temperatura camerei.

Sec ionarea

Se folose te un microtom care executa sec iuni foarte fine, seriate.

Etalarea

Pe lama de sticla se va aplica o picatura de albumina Mayer sau solu ie apoasa de gelatina (0,1-0,2%) care se va intinde in lungul lamei. Din seria de sec iuni se vor indeparta 3-4 fragmente care se pun cu partea lucioasa in jos pe suprafa a unsa. Se picura apa astfel incat sa pluteasca, se a eaza pe o platina incalzita astfel incat preparatele sa se intinda. Lamele se vor tine apoi la termostat la 37 ⁰C pentru ca sec iunile sa se usuce i sa se lipeasca.