EXTRACTIA GAMMAGLOBULINELOR DIN SER SANGVIN PRIN PRECIPITARE CU SULFAT DE AMONIU

EXTRACTIA GAMMAGLOBULINELOR DIN SER SANGVIN PRIN PRECIPITARE CU SULFAT DE AMONIU

Serul sanguin utilizat in aceasta lucrare cu material biologic contine un numar foarte mare de proteine , care se separa prin electroforeza pe gel de agar/agaroza sau pe folie de acetat de celuloza in cinci fractiuni ( albumina , alfa1 , alfa2 , beta , gamma globuline ) .

Fractiunea gamma globulinica a serului contine majoritatea imunoglobulinelor criculante din sange .

Operatia de extractie a gamma globulinelor din ser este motivata de necesitatea separarii si concentrarii anticorpilor si inlaturarea proteinelor inactive din acest punct de vedere .

Principiul metodei

Gaurile au efecte puternice asupra solubilitatii proteinelor globulare .

Capacitatea sarurilor neutre de a influenta solubilitatea proteinelor este dependenta de taria ionica , marime ce masoara atat concentratia cat si numarul de sarcini electrice ale cationilor si anionilor formati de sare .

Pe masura ce taria ionica creste , solubilitatea proteinei incepe sa scada . La o tarie ionica sufficient de mare o proteina poate fi precipitate aproape complet din solutie , efect numit salifiere .

Proteinele precipitate prin salifiere isi pastreaza conformatia lor native si pot fo dizolvate din nou , de obicei fara denaturare .

Datorita solubilitatii mari , prin care se poate realiza o tarie ionica foarte mare , se prefera ca sare precipitate sulfatul de amoniu .

Materiale

solutie saturata de sulfat de amoniu intr-un balon de 1 l se dizolva 550 g sulfat de amoniu in 600 ml apa distilata . Pentru dizolvare se incalzeste solutia la 60-90⁰C pana cand substanta se dizolva aproape in totalitate . Se filtreaza solutia fierbinte . Cand solutia filtrata a atins temperatura camerei , se adduce la 990 ml cu apa distilata . Solutia se prepara cu cel putin 24 ore inainte de folosire . Se neutralizeaza cu amoniac la pH= ( Observatie : pH-ul va fi determinat numai dupa diluarea solutiei cu apa distilata in raport 1:10 ) .

ser fiziologic tamponat , pH=7,4:1 , 792 gr. Na₂HPO₄ · 12H₂O + 0,22g NaH₂PO₄ · H₂O +8,5 g NaCl se dizolva in 500 ml apa . Se adduce la pH=7,4 cu Na₂HPO₄ sau cu NaH₂PO₄ . Se adduce la 1000 ml cu apa distilata .

ser sanguin uman nehemolizat .

Mod de lucru

Intr-un balon Erlenmayer care se pune intr-un cristalizor cu gheata se pun 50 ml ser sanguine . Se pune baia de gheata cu balonul cu ser pe un agitator electromagnetic si se mentine serul 10 min. sub agitare pentru racier . Se adauga , continuand agiatrea , putin cate putin un volum egal de sulfat de amoniu .

Precipitatul rezultat se lasa in frigider 1 ora dupa care se centrifugheaza 20 min. la 5000 r.p.m.

Se indeparteaza supernatantul iar sedimentul se resuspenda in 50 ml ser fiziologic tamponat . Pentru indepartarea sulfatului de amoniu , solutia de gamma globuline obtinuta se dializeaza la rece 24 ore contra serului fiziologic . Controlul se poate face cu reactiv Nessler ( reactie pozitiva pentru NH₄⁺ ) .