HISTOENZIMOLOGIE, HISTOCHIMIE

HISTOENZIMOLOGIE, HISTOCHIMIE

METODA FROTIURILOR

n      se realizeaza intinderea celulelor in monostrat pe o lamela de sticla.

n      Pot fi examinate :

1. celulele sangvine
2. celulele epiteliale descuamate sau exfoliate
3. sedimentele celulare

TIMPII

n      recoltare

n      intindere: se folosesc doua lame de sticla

u    lama portobiect - cea pe care se efectueaza frotiul

u    lama executoare - cu care se intinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45

n      uscare

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

n      pentru colorarea frotiului sangvin.

1. solutia May-Grunwald - contine EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra
2. solutia Giemsa - contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra

Frotiul trebuie sa fie :

n      subtire - cu un singur strat de celule

n      intins uniform

n      ambele margini pe lama

n      se termina in franjuri pe lama , ocupand cca. 2/3 din aceasta

n      la margine se scrie numele pacientului sau un nr. de ordine

REZULTATE

n      nuclei - violet

n      citoplasmele agranulocitelor - albastru citoplasmele granulocitelor - roz

n      granulatii

u    neutrofile - rosu- violet

u    bazofile - albastru inchis spre negru

u    eozinofile - rosu -portocaliu

HISTOCHIMIA

n      interpretarea biochimica a celulelor sau tesuturilor in raport cu oranizarea lor celulara.

PRINCIPIU

Se bazeaza pe afinitatea pe care o au unii coloranti pentru anumite grupari chimice pe care vrem sa le localizam.

n      Substantele chimice celulare si tisulare se identifica prin reactii chimice care duc la obtinerea de compusi colorati , insolubili si observabili la M.O.

n      HISTOFOTOMETRIA = analiza cantitativa, in functie de intensitatea culorii

Conditiile minime necesare unei reactii histochimice

n      substanta analizata

u    sa se conserve "in situ" ,

u    fixarea utilizata trebuie sa conserve structura celulei si sa impiedice deteriorarea componentelor celulare

u    metoda folosita trebuie sa fie specifica pentru substanta sau gruparile chimice care vor fi examinate.

n      produsul de reactie

- insolubil - previne dispersia sau difuzia produsului de reactie

colorat - permite examinarea

n      reactivul histochimic - trebuie sa fie specific.

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR

n      monozaharide

solubile

n      oligozaharide

n      polizaharide libere sau combinate cu proteine

n      METODA PAS ( per-iodic acid Schiff)

n      METODA CU CARMIN AMONIACAL BEST

n      BAZOFILIA

n      METACROMAZIA

METODA PAS

n      evidentierea glicogenului, GAG, glicoproteinelor si glicolipidelor.

n      PRINCIPIU

grupari glicol oxidare cu acid periodic grupari aldehidice + cu reactivul Schiff precipitat rosu violaceu vizibil la M.O

METODA PAS- GLICOGEN

n      specificitatea metodei depinde de pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei salivare. Se considera ca structurile colorate PAS care dispar in urma pretratamentului cu amilaza contin glicogen

CARMIN AMONIACAL BEST

n      evidentiaza glicogenul polimer cu solubilitate redusa in apa . Daca fixarea lui nu este prompta, enzimele hidrolitice il descompun in glucoza care este foarte solubila in apa si difuzeaza.

n      REZULTATE : granule rosii in citoplasma

BAZOFILIA

n      proprietatea substantelor glucidice de a se colora cu coloranti bazici de tipul albastru alcian si albastru de metil.

n      poate fi utilizata si pentru evidentierea lipidelor si proteinelor cu caracter acid

METACROMAZIA

n      Capacitatea unui substrat de a se colora intr-o alta culoare decat cea a colorantului.

n      PRINCIPIU:

- existenta unor grupari anionice aflate la o distanta foarte mica una de alta formand agregate cu proprietati de absorbtie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate.

HISTOCHIMIA LIPIDELOR

n      PRINCIPIU:

colorantul trebuie sa fie mai solubil in lipide decat in propriul solvent

SUDANOFILIA

n      Coloranti Sudan :

n      III - rosu-portocaliu

n      IV - rosu

n      B - negru

n      BB - albastru

n      HISTOCHIMIA Pdetecteaza structura primara a proteinelor

n      Reactii nespecifice proteinele celulare si tisulare sunt identificate pe seama aminoacizilor

n      Reactii specifice - folosite pentru identificarea heteroproteinelor

ROTEINELOR

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reactii nespecifice

u    Tirozina - Reactia MILLON

u    Arginina - Reactia SAKAGUSHI - pentru studiul distributiei proteinelor bazice in nucleu

u    Triptofan

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice

n      folosite pentru identificarea heteroproteinelor de ex. nucleoproteinele care se evidentiaza pe seama acizilor nucleici.

1. Metoda FEULGEN
2. Bazofilia
3. Metoda BRANCHET
4. METODA FEULGEN

Molecula AND hidroliza acida dezoxiriboza + reactiv Schiff precipitat rosu-violaceu

METODA BRANCHET( verde metil-pironina

n      cercetarea bazofiliei data de acidul fosforic din structura acizilor nucleici

n      verde de metil - are afinitate pentru ADN-ul nuclear pe care il coloreaza in verde

n      pironina - ARN-ul nucleolar si citoplasmatic pe care il coloreaza in rosu

HISTOCHIMIA ENZIMELOR

n      evidentiaza localizarea si activitatea enzimelor.

n      PRINCIPIU:

reactii chimice care au ca rezultat un compus colorat si insolubil. In cazul in care produsul rezultat este solubil , se insolubilizeaza printr-o reactie de CAPTURA

ETAPELE OBTINERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC

n      recoltarea

n      fixarea - prin congelarea rapida la temparaturi foarte joase

n      sectionarea

n      incubarea -intr-un mediu care ofera enzimei conditii cat mai apropiate de cele in vivo.

n      montarea - se realizeaza in mediu hidrosolubil - glicerina sau sirop Apathy

REACTII CITOENZIMOLOGICE

n      METODA PEARSE evidentiaza dehidrogenazele

n      METODA GÖMÖRY ( captura de ioni metalici evidentierea hidrolazelor

METODA PEARSE

n      peroxidaze

n      Succinatdehidrogenaza

APLICATII PRACTICE

- SDH - enzima marker a mitocondriilor

METODA GÖMÖRY( captura de ioni metalici

n      pentru evidentierea fosfatazelor

n      PRINCIPIU

o reactie de precipitare a acidului fosforic eliberat de enzima de la nivelul substratului

METODA GÖMÖRY

Compusul rezultat din actiunea enzimei reactioneaza cu

u    sulfura de amoniu pentru a produce un precipitat negru

u    sulfura de cobalt pentru hidrolaza alcalina

u    sulfura de plumb pentru cea acida

u    APLICATII PRACTICE

- evidentierea fosfatazei alcaline - enzima cu rol de transport