MUTAGENEZA IN AMELIORAREA PLANTELOR

MUTAGENEZA IN AMELIORAREA PLANTELOR

1. Definitie

Mutageneza este metoda de ameliorare genetica in care se valorifica efectul agentilor mutageni asupra materialului genetic al plantelor si anume mutatia. In sens larg, mutatia poate fi definita ca o modificare a materialului genetic, care nu e provocata de recombinarea genetica sau de segregare.

Termenul de mutatie provine din latinescul mutatio = schimbare, insemnand o variatie ereditara permanenta si transmisibila celulelor fiice si generatiilor urmatoare. Acest termen a fost introdus in 1901 de Hugo de Vries, care a studiat fenomenul schimbarii substantei ereditare la Lumanarica (Oenothera lamarckiana), insa fenomenul s-a dovedit a nu fi mutatie ci o gresala de distributie a cromozomilor metafizici.

2. Importanta mutatiilor

Mutatiile sunt indiferente din punct de vedere al efectului foarte rar, de cele mai multe ori ele afecteaza negativ individul si devin avantajoase numai in cazuri exceptionale. Totusi ele stau la baza evolutiei prin sporirea variabilitatii, precum si prin cresterea numarului de combinatii posibile in cazul cresterii numarului de alele. In ameliorarea plantelor, mutatiile sunt folosite cu succes in special la obtinerea unei rezistente la boli si daunatori. Realizari notabile din acest punct de vedere sunt :

W.C. Gregory (1955) a izolat o mutanta de alune de pamant rezistenta la patarea frunzelor, boala foarte pagubitoare pentru aceasta specie.

F.C. Elliot (1956) - a transferat prin iradieri rezistenta la rugini a speciei Agropyron elongatum la graul hexaploid (Triticum aestivum). Mecanismul a fost explicat prin producerea in urma iradierii a unor rupturi cromozomiale si translocatii.

A. Moes (1959) si J. Mackey (1964) au obtinut la grau, orz si ovaz mutante rezistente la diferite specii de rugini.

In prezent, metoda de mutageneza este larg utilizata la din ce in ce mai multe specii, urmarindu-se obtinerea de indivizi cu rezistenta crescuta la boli si daunatori.

Unele mutatii ce au importanta practica atrag dupa sine o modificare poate nedorita si a unui alt caracter. Spre exemplu, s-a stabilit existenta unei corelatii intre scurtarea indusa a paiului si scaderea productiei. De aceea, utilizarea eficace a mutatiilor necesita o hibridare cu soiul mama sau, uneori, cu alte soiuri. Atfel, prin selectie se poate realiza eliminarea mutatiilor negative si fixarea caracterului cautat. Un astfel de sistem de selectie a fost cel introdus de Fossati A. (1972), care este redat in figura 1.

Fig. 1. Obtinerea, selectia si folosirea mutantelor

Conform acestei scheme, semintele iradiate sunt semanate in camp si formeaza populatia M1. Indivizii acestei populatii poarta mutatiile in stare heterozigota, atfel ca numai in generatia M2 pot apare mutatii in stare homozigota, mutatii pe care amelioratorii sa le poata depista. Toate descendentele mutante se urmaresc separat si apoi sunt studiate in culturi comparative. Acest mod de selectie este bine utilizat in cazul macromutatiilor valoroase.

Selectia formelor mutante este prezentata schematic in figura 2. Semintele plantelor tratate sau semintele supuse influentei diferitilor agenti mutageni se insamanteaza in conditii controlate sau direct in camp.

Fig.2. Selectia formelor mutante

Clasificarea mutatiilor

Mutatiile pot aparea in mod spontan (mutatii naturale) sau pot fi induse experimental (mutatii artificiale). O contributie insemnata in domeniul producerii artificiale a mutatiilor au avut-o cercetatorii suedezi in frunte cu A. Gustafsson care au obtinut numeroase mutante utile pentru procesul de ameliorare la cereale si alte plante cultivate, precum si cercetarile initiate de H. Stubbe (inca din anul 1930) la cereale, tomate si Antirrhinum, care a investigat semnificatia radiatiilor ionizante in ameliorarea plantelor. E. Mayr, a definit mutatiile ca ,,modificari discontinue cu efect genetic" care pot afecta diferite unitati ale materialului genetic:

genele - mutatii genice;

cromozomii - mutatii cromozomiale;

intregul genom - mutatii genomice.

In cadrul mutatiilor genice, se disting mutatii care afecteaza genele structurale, operationale sau reglatoare, precum si mutatii care afecteaza regiuni mai mici din gena (mutatii intragenice), putand afecta chiar si o singura pereche de nucleotide (mutatii punctiforme).

La organismele diploide, mutatiile pot fi clasificate dupa modul de exprimare fenotipica in:

mutatii dominante;

mutatii codominante ;

mutatii semidominante ;

mutatii recesive.

Un alt criteriu de clasificare este cel al plasarii mutatiilor in cromozomi :

mutatii autozomale ;

mutatii heterozomale.

Pot exista si mutatii extranucleare, cele care afecteaza materialul genetic din citoplasma. De asemenea s-au putut evidentia mutatii letale sau semiletale, care afecteaza gene de importanta majora in organism, prin blocarea carora se poate produce moartea individului inainte de maturitatea sexuala. Prin mutatie, gena normala a tipului salbatic se poate transforma intr-o alela diferita (mutatie directa / forward mutation) sau gena mutanta se retransforma in tipul initial (mutatie de reversie / back - mutation). O sinteza a clasificarii mutatiilor poate fi analizata in tabelul urmator :

Tabelul 1. Clasificarea mutatiilor dupa mai multe criterii de clasificare

(sinteza dupa C. Leonte, 2005)

4. Tehnica mutagenezei

Pentru a obtine forme mutante de plante se utilizeaza agenti mutageni fizici sau chimici, precum si combinat, a caror actiune se aplica o data sau de mai multe ori, la seminte, organe ale plantei sau chiar la planta intreaga.

Momentul de aplicare a agentilor mutageni este diferit, in functie de specia utilizata ca material initial de ameliorare, cat si scopul urmarit.

In orice situatie trebuie avuta insa in vedere doza letala a agentului mutagen utilizat (DL 50%) si de obicei, in cadrul experientelor se aplica doze diferite din acelasi agent mutagen, pentru a vedea atat gradul de afectare a materialului genetic, cat si pentru siguranta obtinerii efectului mutagen.     Materialul biologic folosit in mutageneza trebuie sa indeplineasca mai multe conditii si anume:

ciclu vital scurt ;

prolificitate ridicata;

numar redus de cromozomi, de dimensiuni mari, care se diferentiaza intre ei usor din punct de vedere morfologic;

caractere si insusiri distincte, usor de evidentiat ;

conditii ieftine de experimentare, usor de realizat.

Fig. 3. Clasificarea agentilor mutageni

4.1. Agentii mutageni fizici

Factorii mutageni fizici reprezinta un real interes pentru mutageneza experimentala deoarece produc o frecventa relativ mare de mutatii. Factorii mutageni fizici actioneaza asupra acizilor nucleici in stare de repaus. Din aceasta categorie fac parte radiatiile, variatiile de temperatura si ultracentrifugarea.

Prakken R. (citat de Nicolae N., 1978) a clasificat radiatiile dupa capacitatea lor de ionizare, in doua categorii: radiatii ionizante si radiatii neionizante.

Radiatiile ionizante sunt cele care produc reactii radiochimice. Din aceasta categorie fac parte radiatiile electromagnetice si cele corpusculare.

Radiatiile electromagnetice sunt reprezentate de radiatiile norului electronic al atomilor si sunt produse de dezintegrarile radioactive. Din aceasta categorie fac parte razele Röentgen (X) o lungime de unda de 0,5 si 100 Å si radiatiile gamma (γ) cu lungimea de unda cuprinsa intre 1,4 Å si 0,005 Å. Desi razele Röentgen sunt mai putin nocive pentru operator si chiar daca au o putere de penetrare mai redusa sunt mult mai folosite decat razele gamma.

Radiatiile corpusculare sunt reprezentate de un flux de atomi care se deplaseaza cu o viteza variabila. Ele sunt impartite in trei grupe: particule elementare usor incarcate electric (electronii si protonii), particule grele incarcate electric (protoni, deutroni si particule α) si particule neutre (neutronii). Cele mai utilizate elemente corpusculare in biologie si agricultura sunt razele (α), beta (β) si netronii.

Radiatiile neionizante provoaca excitatii la nivel molecular prin intermediul reactiilor fotochimice pe care le produc. Dintre acestea, cel mai des utilizate sunt radiatiile ultraviolete. Razele ultraviolete sunt fotoni cu energie joasa si cu lungime de unda cuprinsa intre 136 si 4000 Å. Cercetarile recente au aratat ca razele ultraviolete au o lungime de unda de 2 580 Å, care corespund spectrului de absorbtie al ADN si au cel mai puternic efect mutagen.

Actiunea radiatiilor asupra organismelor vii este foarte profunda si complexa. Patruzand in organismele vii radiatiile ionizante actioneaza in doua sensuri: pot da nastere la mutatii sau pot produce leziuni letale.

Patrunse in celule, radiatiile actioneaza asupra ultrastructurii celulare, indiferent daca acestea sunt citoplasmatice sau nucleare.

Iradierea prezinta unele particularitati determinate de sursa utilizata, precum si de planta sau organul iradiat si poate actiona direct asupra materialului de ameliorat sau, indirect, prin intermediul mediului nutritiv sau al plantei gazda.

Eficienta iradierii asupra organismelor in vederea provocarii mutatiilor depinde, dupa cum arata Dubinin N.P. (1966), de intensitate, durata de actiune si tipul radiatiilor, de substratul genetic asupra caruia se actioneaza, de viteza diviziunii, de sensibilitatea leziunilor provocate. Eficienta iradierii este influentata de pH, continutul in apa, continutul in oxigen, temperatura.

Datorita sensibilitatii diferite a diverselor organe si a specificitatii reactiei genelor fata de mutageni, aplicarea radiatiilor trebuie facuta diferentiat.

Iradierea se aplica in diverse faze de vegetatie. Daca aplicarea se face o singura data, cu o doza masiva, se face o iradiere acuta si care se aplica de regula semintelor in stare de repaus. In cazul in care tratamentul este indelungat iradierea este cronica, dozele fiind moderate.

Pentru stabilirea dozelor de radiatii s-au facut numeroase cercetari, intrucat efectul mutagen maxim are loc la fiecare specie si chiar la fiecare soi numai la anumite doze.

Conventional, s-a stabilit ca doza corespunzatoare de iradiere, pentru fiecare specie, doza care opreste cresterea sau provoaca moartea la 50% din indivizii iradiati.

Aceasta valoare este cunoscuta sub denumirea de doza letala si se noteaza cu DL 50% si variaza in limite foarte largi de la o specie la alta, si chiar in cadrul speciei de la un soi la altul. Doza de iradiere nu trebuie sa depaseasca DL 50%, adica doza care provoaca moartea a 50% din indivizi (tabelul 2).

Tabelul 2. Doza letala 50% la cateva specii de plante

4.2. Agentii mutageni chimici

In ultima vreme, eforturile oamenilor de stiinta sunt concentrate asupra efectelor mutagene ale diferitelor substante chimice, dintre care unele sunt mult mai active decat radiatiile ionizante.

In comparatie cu radiatiile ionizante, care patrund usor in materia vie, agentii chimici pot ramane in straturile superficiale ale corpului, pot fi eliminate inainte de a procuce mutatii, pot fi metabolizate in alti compusi inofensivi pentru organism.

Din aceste considerente, inducerea de mutatii cu ajutorul substantelor chimice mutagene prezinta o serie de avantaje:

aplicarea tratamentelor se face mai usor decat iradierea;

pericolul poluarii mediului exterior este redus complet;

interactiunea dintre mutagen si materialul biologic se face cu eficacitate;

procentul indivizilor supravietuitori este mai mare;

frecventa mutatiilor pentru unii mutageni chimici este de 5 - 10 ori mai mare.

Factorii mutageni chimici se impart, conform clasificarii lui Freese E. (1963), in doua categorii:

substante care actioneaza in decursul biosintezei replicatoare, grupa din care fac parte analogii bazelor azotate, acridinele, inhibitori de concurenta a precursorilor acizilor nucleici;

substante care actioneaza asupra acizilor nucleici in stare de repaus: acidul azotos, hidroxilamina, hidrazina, substantele alchilante.

In prezent, clasificarea agentilor chimici mutageni se face in raport cu starea functionala a ADN-ului, care intermediaza activitatea mutagena a acestora. Intre substantele mutagene a caror actiune este cunoscuta, amintim: azoserina, cofeina, timidina, 5-bromuracil, 2-aminopurina, iperita, formaldehida, fenolul, etc.

Cele mai importante si folosite adesea pentru producerea de mutatii utile sunt agentii alchilanti. Dintre aceste substante mentionam: iperita, dietilsulfatul, etilmetansulfonatul, etilenimina, epoxizii, azaserina, etc.

Dintre substantele alchilante folosite mai frecvent pentru inducerea de mutatii la plante mentionam: etilenimina (EI), etilmetansulfonatul (EMS) si dietilsulfatul (DES) (tabelul 3).

Tabelul 3    Concentratiile folosite la principalele substante alchilante

la cateva specii de cultura

De asemenea, s-au dovedit utile pe langa cele prezentate mai sus si hidroxilamina, nitrozoetil ureea, nitrozometil ureea.

In tratarea cu substante chimice, doza nu poate depasi anumite limite, atat datorita faptului ca aceste substante sunt putin solubile, cat, mai ales, datorita nocivitatii lor foarte pronuntate. Un rol aparte in cadrul substantelor chimice il are colchicina, care are ca principal efect dublarea garniturii cromozomale, fiind, deci, un factor poliploidizant.

4.3. Agentii mutageni biologici

In urma diverselor cercetari s-a constatat faptul ca unele enzime pot avea un efect slab mutagen, de asemenea si unele virusuri si insecte parazite pot produce mutatii prin intermediul produsilor lor metabolici.

Acesta latura a mutagenzei nu a fost suficient explorata de catre cercetatori si de aceea necesita studii suplimentare.